ЕФЕКТИВНІСТЬ БІПРОЛОЛУ ПРИ ЗАСТОСУВАННІ З МЕТАБОЛІТНИМИ ПРЕПАРАТАМИ ( КВЕРЦЕТИН, ТІОТРИАЗОЛІН) У ЩУРІВ ЗІ СПОНТАННОЮ АРТЕРІАЛЬНОЮ ГІПЕРТЕНЗІЄЮ

Краткое содержание

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження здійснені згідно з вимогами та рекомендаціями ФЦ МОЗ України "Про затвердження порядку проведення доклінічного вивчення лікарських засобів, порядку визначення установ, які проводять доклінічне вивчення лікарських засобів" (Наказ МОЗ України № 441 від 01.11.2001 зі змінами, внесеними за Наказом Міністерства охорони здоров'я №602 від 14.11.2005). У дисертаційній роботі застосовували препарати: біпролол і кверцетин – виробництва ЗАТ НВЦ "Борщагівський ХФЗ", тіотриазолін – виробництва НВО «Фарматрон», інші хімічні та біохімічні реактиви – фірми «Sigma» (США).

Досліди проведені на 175 статевозрілих білих щурах обох статей з початковою масою 150 – 240 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію Національного медичного університету імені О.О. Богомольця за вільного доступу до води та їжі згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ. Індивідуальна ідентифікація: згідно з СОП №1.1, 1.2.  Тварини перебували у стані, який не впливав на наслідки досліду. До експериментальних досліджень не залучалися тварини, що не пройшли необхідний карантин та акліматизацію або використовувалися в інших дослідженнях. Перед початком проведення експериментів щури акліматизовувалися до умов віварію не менше 14 діб.

Відібрані та попередньо індивідуально позначені тварини розподілялися на групи за методом випадкового вибору з використанням таблиці випадкових номерів. Тварин  розміщували окремо в спеціалізованих клітках з термопластика та металевої гратки з постійним доступом до скляної автопоїлки.

Усього досліджено 30 нормотензивних WKY (normotensive Wistar-Kyoto rats) та 145 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією лінії НІСАГ. Експериментальні тварини поділили на 7 груп: 1 – інтактна група з 30 нормотензивних щурів. 2 – контрольна група – 30 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією. 3 – група з 23 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, яким уводили біпролол дозою 20мг/кг. 4 – група з 23 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, що отримували біпролол 20мг/кг. + кверцетин 50мг/кг. 5 – група з 23 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, яким уводили кверцетин в дозі 50мг/кг. 6 – група з 23 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, яким уводили біпролол 20мг/кг + тіотриазолін 50мг/кг. 7 – група з 23 щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, вони одержували тіотриазолін дозою 50мг/кг. Розчинником для всіх препаратів слугувала вода. Перед оральним введенням щурів зважували і давали препарати. Вибір ефективних доз визначали на основі літературних даних. При цьому базувались також на прийнятих в експериментальних дослідженнях положеннях, що доза речовин четвертого класу токсичності для внутрішньошлункового введення дорівнює 5 г/кг, для внтурішньоочеревинного шляху – 1 г/кг. Використані дози антигіпертензивного препарату біпрололу та метаболітних препаратів тіотриазоліну  і кверцетину розраховані з урахуванням даних літератури (Н.П. Максютина, 1994., І.Ф. Беленічев, 2000.,  A. Benetos, 1994).

 Тварин вилучали з експерименту за обставин, не пов’язаних із застосуванням препарату. Тривалість досліду 90 днів.

Артеріальний тиск вимірювали на хвостовій артерії щурів за допомогою спеціального приладу (плетизмограф) та реєстрували у міліметрах ртутного стовпчика (мм рт. ст.).

Осмотична резистентність еритроцитів (ОРЕ) – це показник, що характеризує  проникність еритроцитарних мембран і дає змогу оцінити ранні зміни у мембранних процесах, тобто з’ясувати функціональний стан клітин. ОРЕ визначали за методом Дейсі, принцип якого полягає в зміні ступеня гемолізу еритроцитів (у відсотках) у серії забуферених гіпотонічних розчинів натрію хлориду від 0,5% до 0,1%, рН 7,4. Гемоліз еритроцитів встановлювали на фотометрі. найменш стійкі клітини лізуються у 0,5 – 0,45% - них розчинах, а найстійкіші у 0,35 – 0,1% розчинах. Збільшення кількості еритроцитів, лізованих  у низьких концентраціях NaCl, свідчить про зниження ОРЕ, тобто посилення проникності мембран. Перерозподіл лізованих клітин у бік вищих концентрацій засвідчує підвищення резистентності і, відповідно, зниження проникності клітинних мембран. Найбільш показовішими є дані, отримані в 0,4% розчині натрію хлориду, тому  про ті чи інші зміни ОРЕ ми робитимемо висновки за відхиленням показника саме у цьому розчині.

Функціональний стан системи вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ВРПОЛ)  досліджували у змішаній артеріально-венозній плазмі крові та гомогенаті міокарда щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією. Для цього використовували метод реєстрації спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ) за допомогою хемілюмінометра ХЛМ1Ц-01. Зразки плазми  крові отримували, змішуючи у скляних пробірках 0,2 мл артеріально-венозної крові з 9,0 мл калійного фосфатного буферного розчину для хемілюмінесценції (розведення 1:46) з метою запобігання згортанню. рівень СХЛ біологічного субстрату визначали за показниками хемілюмінометра протягом 1 хв (імп/хв). У гомогенатах тканини міокарда щурів встановлювали вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБКАС) та виражали в наномоль/ г тканини за 30 хв.

 Для патоморфологічного дослідження міокард нормотензивних та гіпертензивних щурів фіксували в 10% нейтральному формаліні, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації, хлороформ, хлороформ-парафін і заливали у парафін. Серійні парафінові зрізи завтовшки 7 мкм виготовляли на санному мікротомі, забарвлювали гематоксиліном й еозином і за методикою Ван Гізона. Основні гістохімічні показники досліджено на свіжозаморожених кріостатних зрізах міокарда завтовшки 10 мкм. Оцінку енергетичного обміну в тканинах міокарду проведено на підставі з’ясування активності комплексу ферментів:

а) стан процесів у циклі Кребса виявляли за активністю  сукцинатдегідрогенази – (СДГ) – за Нахласом та співавт. і малатдегідрогенази – (МДГ) – за Гессом, Скарпеллі і Пірсом;

б) сумарну активність ферментів дихального ланцюга визначали за зміною активності НАД-Н дегідрогенази за Фарбером;

в) утворення енергії у гліколітичному циклі оцінювали за зміною активності: цитоплазматичної a-гліцерфосфатдегідрогенази (a-ГФДГ) і лактатдегідрогенази – (ЛДГ) – за Гессом, Скарпеллі і Пірсом;

г) визначали активність: глюкозо-6-фосфатдегідрогенази-(Г-6-ФДГ) –  пентозний цикл – за Гессом, Скарпеллі і Пірсом; а також НАДФ-Н ДГ – як показника активності всієї НАДФ-Н генеруючої системи дегідрогеназ – за Фарбером;

д) показники енергетичного обміну (утворення енергії, переносу та утилізації енергії) встановлювали за рівнем активності аденозинтрифосфатази (АТФ). Застосовані гістохімічні та патоморфологічні методики виконані за Б. Ромейсом.

Для електронномікроскопічних досліджень матеріалом слугував міокард лівого шлуночка серця. Фрагменти міокарда фіксували 1% розчином чотириокису осмію  на веронал-ацетатному буфері за Колфільдом. Зневоднювали у спиртах зростаючої концентрації (70–100 %) та ацетоном. Заливали у суміш епону та аралдіту, згідно із загальноприйнятою методикою (В.Я. Каруп,1984). Напівтонкі та ультратонкі зрізи з блоків отримували на ультратомах LKB (Швеція) та Reichert (Австрія). Ультратонкі зрізи контрастували 2% розчином уранілацетату та цитратом свинцю. Препарати досліджували під електронним мікроскопом ПЕМ-125К.

Для визначення площі та щільності ядер, концентрації РНК в ядрах і цитоплазмі кардіоміоцитів тканини міокарда експериментальних тварин занурювали у 10% нейтральний формалін і після гістологічної проводки в батареї спиртів зростаючої концентрації тканину укладали в парафін. зрізи завтовшки 5 мікрон виготовляли на ротаційному мікротомі, депарафінували і забарвлювали галоціанін-хромовим галуном для визначення нуклеїнових кислот за Ейнарсоном. Морфометричні дослідження проводили на мікроскопі Axioskop (Ziess, Німеччина). Зображення клітин, отримувані на мікроскопі, за допомогою високочутливої відеокамери Cohu-4922 (COCHU Inc., США) вводили в комп'ютерну програмно-апаратну систему цифрового аналізу зображення VIDAS. Зображення аналізували у напівавтоматичному режимі.

Отримані результати оцінювали на підставі статистичної обробки методом варіаційної статистики ПК за допомогою спеціалізованої програми “STATISTICA”. Вірогідність різниці між  досліджуваними показниками оцінювали за критерієм t Ст’юдента. Різницю між показниками вважали статистично вірогідною за Р ≤ 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. У щурів зі САГ, які отримували біпролол, артеріальний тиск на початку експерименту дорівнював у середньому 148±6,5 мм рт. ст., а через 90 діб знизився  до 121±5,3 мм рт. ст., що статистично ймовірно нижче показника до лікування, хоча і не досягає контрольних величин, статистично перевищуючи їх. У щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією, яким вводили кверцетин, артеріальний тиск до та після лікування дорівнював 162±6,6 мм рт. ст. та 158±6,0 мм рт. ст. відповідно, що вірогідно не відрізнялося від показників у гіпертензивних щурів без лікування. Сумісне застосування біпрололу з кверцетином протягом 90 днів статистично достовірно знижувало артеріальний тиск у щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією з 154±5,5 мм рт. ст. до 122±5,6 мм рт. ст. Монотерапія тіотриазоліном у щурів із САГ не змінювала артеріальний тиск  упродовж 90 днів, який дорівнював 147±6,0 мм рт. ст.  та 142±5,6 мм рт. ст. до та після лікування. Сумісне введення біпрололу і тіотриазоліну протягом 90 днів спричинювало у щурів зі спонтанною артеріальною гіпертензією найбільш помітне зниження  артеріального тиску – з 145±5,3 мм рт. ст. до 119±6,1 мм рт. ст., що  статистично ймовірно не відрізняється від показника артеріального тиску у нормотензивних щурів. (табл. 1).

При спонтанній гіпертензії підвищується рівень ангіотензину ІІ, який спричиняє дисфункцію ендотелію, секрецію активних форм кисню, активацію перекисного окиснення ліпідів (Ефремов А.В. и соавт., 2000). Тому наступним етапом, було визначення впливу досліджуваних препаратів,  на процеси перекисного окиснення ліпідів у міокарді і крові щурів зі САГ. Встановлено, що в крові цих тварин зростала спонтанна хемілюмінесценція на 47%. Підтвердженням інтенсифікації процесу ПВЛ було підвищення маркера інтенсивності – сполук,  які реагують з тіобарбітуровою кислотою, – на 35%. Подібна спрямованість змін спостерігалася і в міокарді щурів зі САГ. Біпролол знижував спонтанну хемілюмінесценцію  в плазмі крові та міокарді на 22%, вміст сполук, які реагують з тіобарбітуровою кислотою, – на 14%. Тіотриазолін як потужний антиоксидант зменшував спонтанну хемілюмінесценцію на 23%, вміст сполук, які реагують з тіобарбітуровою кислотою, – на 10%. Вагоміші результати щодо пригнічення процесів перикисного окиснення ліпідів отримано за умови спільного застосування біпрололу і тіотриазоліну. Поєднання препаратів знижувало спонтанну хемілюмінесценцію в плазмі крові і міокарді на 41%, вміст продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою, – на 22%.