ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЗАСТОСУВАННЯ ЕКСТРАКТУ З МІДІЇ ЧОРНОМОРСЬКОЇ (Mytilus galloprovincialis Lam.) У КОМПЛЕКСНІЙ ТЕРАПІЇ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. У роботі було використано 320 статевозрілих самців щурів лінії Вістар та 18 кролів породи Шиншила з віварію ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України», а також  60 статевозрілих самиць щурів лінії Вістар із віварію Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна.

Тварин утримували в стандартних умовах віварію при природному освітленні та харчовому режимі, рекомендованому для даного виду тварин. Дослідження проводилися відповідно до національних „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985).

У роботі досліджували екстракт із мідії чорноморської (Mytilus galloprovincialis Lam.), що був вироблений у відділі біотехнологічних досліджень Південного НДІ морського рибного господарства та океанографії (м. Керч). Екстракт являє собою в'язку субстанцію шоколадного кольору з характерним смаком і виглядом, є розчинним у воді та органічних розчинниках. За результатами дослідження його гострої токсичності встановлено, що він відноситься до практично нетоксичних речовин (п’ятий клас токсичності) (Устенко Н. В. та співавт., 2008). Експериментальним тваринам екстракт надавали перорально в дозі 400 мг на кг маси тіла (мінімальна доза з максимальним терапевтичним ефектом) (Бітютська О.Є. та співавт., 2003), в якості препарату порівняння використовували метформін у дозі 50 мг на кг маси тіла.

Дослідження антидіабетичних властивостей екстракту із мідії чорноморської (Mytilus galloprovincialis Lam.) проводили на хімічно-індукованих моделях інсулінової недостатності та інсулінорезистентності різного ґенеза: 1) алоксановий діабет у щурів (абсолютна інсулінова недостатність   загального  цитотоксичного  ґенеза)  (Полторак  В.В.,  Горбенко Н. І., 2001); 2) високодозовий стрептозотоциновий діабет у щурів (абсолютна інсулінова недостатність прямого бета-цитотоксичного ґенеза) (Rakieten N. et al., 1969); 3) дитизоновий діабет у кролів (абсолютна інсулінова недостатність прямого бета-цитотоксичного ґенеза) (Okamoto H., 1981); 4) експериментальний ЦД 2 типу у щурів (відносна інсулінова недостатність, сполучена з первинною та вторинною інсуліно-резистентністю) – модель відтворюється фінальним введенням стрептозотоцину на тлі хронічної жирової дієти (Гладких О.І. та співавт., 2009).

Глюкозний гомеостаз у щурів оцінювали за рівнем глікемії (базальної та під час ВЧТТГ (внутрішньочеревний тест толерантності до глюкози)). Кров для аналізу брали з хвостової вени після попереднього 4-годинного голодування, а також через 30, 60 і 120 хв після введення глюкози (3 г/кг маси тіла). Проводили інсуліновий тест (0,2 МОд/кг, взяття крові натще та через 15, 30, 60 та 120 хв після підшкірного введення гормону) (Akinmokun A. et al., 1992). Стан глюкозного гомеостазу кролів з дитизоновим діабетом оцінювали за динамікою базальної глікемії та глікемії під час ВВТТГ (внутрішньовенний тест толерантності до глюкози) (500 мг/кг маси тіла, взяття крові у вихідному стані, через 5, 10, 30 та 60 хв). Площу під глікемічними кривими (ПГК, концентрація-час) при проведенні ВЧТТГ і ВВТТГ та показник сумарної базальної глікемії, розрахований за даними 1, 10, 20 та 30 доби експерименту, обчислювали за допомогою комп'ютерної програми "Mathlab". Вміст глюкози в крові оцінювали глюкозооксидазним методом за допомогою ферментативного аналізатора глюкози «Ексан-Г» (Литва), а також фотоколориметричним методом із використанням наборів реактивів «Глюкоза-ФДК», виробництво ТОВ «Фармацевтика и клиническая диагностика» (Росія).

Оксидативний стрес характеризували за показниками первинних продуктів ПОЛ (перекисне окислення ліпідів) ‑ кон'югатів жирних кислот: ДіК (дієнові), ТК (трієнові), ОДК (оксодієнові), ТЕТ (тетраєнові), вміст яких вимірювали  спектрофотометрично (Гаврилова В.Б. та співавт., 1983; Параніч А.В. та співавт., 1990). Рівень вторинних продуктів ПОЛ – МДА (малоновий діальдегід) (Владіміров Ю.А. та співавт., 1975); гідроперекисів ліпідів (Asakawa T., Matsushita S., 1980) – вимірювали фотоколориметрично. Антиоксидантний статус оцінювали за активністю антиоксидантних ферментів: ГПО (глутатіонпероксидаза) (Ланкін В.З. та співав., 1980) та
Г-S-Т (глутатіон-S-трансфераза) (Kraus P., 1980). Усі вищевказані показники вимірювали в гомогенатах печінки, підшлункової залози, у мітохондріях печінки та у крові.

Концентрацію тригліцеридів визначали ферментативним методом за допомогою стандартних наборів фірми «Lahema» (Чеська республіка).

Біоенергетичні показники оцінювали за функціональним станом мітохондрій. Мітохондрії виділяли з гомогенатів печінки щурів методом диференційного центрифугування (Лємешко В.В. та співавт., 1980). Швидкість дихання V₃ (фосфорилюючих) та V₄ (нефосфорилюючих) мітохондрій реєстрували за допомогою полярографічного методу з використанням закритого електроду Кларка (Сєвєрин С.Є. та співавт., 1980).

Ідентификацію апоптозу клітин печінки та підшлункової залози кролів проводили за допомогою методу електрофорезу ДНК в 2 % агарозному гелі, який заснований на верифікації кінцевого етапу деградації ДНК. На електрофореграмах апоптотична фрагментація ДНК виявляється у вигляді «драбинки» із фрагментів ДНК різної довжини. Некроз клітин обумовлює «розмазаний» характер зони міграції ДНК. Виділення ДНК проводили з використанням набору Genomic DNA Purification Kit (Fermentas, Німеччина). В якості стандарту застосовували маркер O’GeneRuler^TM 1kb DNA Ladder (Fermentas, Німеччина). Смуга свічення інтактної ДНК знаходилася в районі старту. Візуалізація та фотографування електрофореграм фрагментованої ДНК проводилася в ультрафіолетовому спектрі з використанням етидіум броміду.