ЛЕКТИНОГІСТОХІМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ПРЕНАТАЛЬНОГО МОРФОГЕНЕЗУ ПРИВУШНОЇ СЛИННОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ

Краткое содержание

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Для дослідження використали 103 препарати: 26 зародків (Зр), 29 передплодів (Пп) і 48 плодів (Пл) людини, що загинули від причин, не пов’язаних із захворюваннями ПСЗ та розвивалися в матці за відсутності явно виражених пошкоджувальних чинників зовнішнього і внутрішнього середовища. Комісією з питань біомедичної етики Буковинського державного медичного університету (прот. № 8 від 16.05.2013) порушень морально-правових правил при проведенні медичних наукових досліджень не виявлено. Матеріал одержували з акушерсько-гінекологічних відділень лікувальних закладів м. Чернівці та області. Препарати Пл понад 500,0 г вивчали безпосередньо в Чернівецькій обласній комунальній медичній установі “Патологоанатомічне бюро”. Для дослідження також були використані колекції серій гістологічних і топографоанатомічних зрізів музею кафедр анатомії людини імені М.Г. Туркевича та анатомії, топографічної анатомії та оперативної хірургії Буковинського державного медичного університету; серійні гістологічні зрізи з колекції „Крим” ДУ “Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського”.

Найдоцільнішим методологічним засобом у морфологічному дослідженні, на наш погляд, є хронологічний підхід. Вік об’єктів дослідження (Зр, Пп, Пл) визначали за таблицями Б.П. Хватова, Ю.Н. Шаповалова (1969), А.И. Брусиловского и др. (1988) на підставі вимірювань тім’яно-куприкової довжини (ТКД).

Нами використано комплекс морфологічних методів дослідження, який включав макроскопію; виготовлення і мікроскопію серій послідовних гістологічних і топографоанатомічних зрізів Зр та Пп людини, ПСЗ плодів різних вікових груп; звичайне і тонке препарування під контролем бінокулярної лупи; морфометрію; виготовлення об’ємних пластичних і комп’ютерних 3-D реконструкційних моделей; лектиногістохімічні та гістохімічні методи; фотодокументування. Виготовлення комп’ютерних 3-D реконструкційних моделей ПСЗ проводили з застосуванням розроблених і запропонованих нами пристрою та способу (патенти № 62645 та № 62646).

            Вік Зр і Пп перших двох місяців розвитку визначали за ТКД після одноденної фіксації в 5-6 % розчині нейтрального формаліну задля досягнення сталості форми драглистого об’єкта і уникнення небажаних огріхів при визначенні ТКД і віку. Використання парафінової заливки уможливило поєднання кількісних, гістохімічних і лектиногістохімічних методів досліджень у серійних зрізах одних і тих же Зр та Пп. Починаючи з 3-го місяця вік Пп та Пл визначали одразу ж при поступленні, до фіксації, шляхом вимірювання ТКД.

            Фіксацію Пл проводили спочатку 5 % розчином нейтрального формаліну впродовж 7 діб, а потім 30 діб – у 10 % розчині нейтрального формаліну тому, що при ній найменше змінюються розміри препарату (Проняев В.И. и др., 1995). Усі Пл досліджені методами макро-, мікропрепарування та виготовлення серійних гістологічних зрізів ПСЗ.

Лектиногістохімічне дослідження проведено на базі ЦНДЛ ДУ „Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського” (зав. лабораторії – професор О.Ю. Шаповалова). Після депарафінізації серійні гістологічні зрізи занурювали в 96^о етанол та для інактивації ендогенної пероксидази інкубували 20 хв. у метанолі, який містив 0,3 % перекису водню. Препарати обробляли з використанням Лк НВК „Лектинотест” (Львів) в їх розведенні 1:50 згідно з рекомендованою методикою (А.Д. Луцик и др., 1989). Візуалізацію місць зв’язування Лк проводили в системі диамінобензидин – перекис водню. Контроль специфічності реакції здійснювали шляхом виключення зі схеми обробки препаратів диамінобензидину. Для обробки гістологічних препаратів використовували Лк: зав’язі пшениці (WGA), бузини чорної (SNA), виноградного слимака (HPA), арахісу (PNA), кліщовини (RCA), бульб картоплі (STA), кори золотого дощу (LABA), сочевиці (LCA). Інтенсивність забарвлення зрізів різними Лк оцінювали в балах методом напівкількісної оцінки.

            Нейтральні вуглеводні компоненти ідентифікували ШЙК-реакцією з паралельним забарвленням зрізів, попередньо оброблених α-амілазою при t° = 36° С у термостаті впродовж 1 години. Їх кількісний вміст в умовних одиницях (у. о.) вимірювали на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 575 нм, а отримані цифрові дані піддавали статистичній обробці, обчислюючи середню арифметичну та її відхилення. Про вміст глікогену (Гг) і глікопротеїнів (Гп) у закладках судили за різницею між кількістю ШЙК-позитивних речовин у препаратах, контрастованих без обробки a-амілазою і після її впливу.

            Волокнисті структури виявляли імпрегнацією сріблом. Із метою отримання диференційованого поліхромного забарвлення різних тканин застосовувалося додаткове фарбування зрізів на предметних скельцях гематоксиліном і еозином, за методом Ван-Гізон, борним карміном, пікрофуксином тощо.

            Для одержання морфометричних даних використовували окуляр-мікрометр і мікрометричну лінійку. Вимірювання клітин та їх ядер проводили з урахуванням рекомендації А. И. Брусиловського (1976) про те, що товщина зрізів повинна в 1,5-2 рази переважати величину середнього діаметра вимірюваних ядер. Каріометрію здійснювали з використанням комп’ютерної програми „Морфологія” фірми UTHSCSA Image Tool Version 2.0 (alpha 2).

  Комп’ютерне опрацювання даних проводили за допомогою статистичного пакета Stat. Soft. Inc; Tulsa, OK, USA; Statistica 6. Використовували непараметричні методи дослідження (U-критерій Уілкоксона, критерій Манна-Уітні, χ-критерій Ван-дер-Вардена). Стандартна похибка для всіх вимірювань не перевищує 5 % (р<0,05).

            Результати дослідження та їх обговорення. Вивчення Зр проведено нами в зародковому періоді ВУР потижнево – від початку 4-го тижня і включно по 6-й тиждень ВУР (1,4-13,0 мм ТКД; вік 21-42 доби).

            Дослідженнями серійних гістологічних зрізів Зр людини 4-го та 5-го тижнів пренатального розвитку не виявлено виокремлення зачатків ПСЗ, що спростовує твердження В.В. Гемонова и др. (2003), В.В. Афанасьєва и др. (2008), Д.В. Баженова и др. (2009) щодо більш ранніх термінів її появи – на 4-му та 5-му тижнях пренатального розвитку.

            Установлено, що зачаток ПСЗ з'являється наприкінці зародкового періоду (Зр 11,0-12,5 мм ТКД; 6-й тиждень ВУР), що підтверджує припущення М.Р. Абдусаламова и др. (2008) у частині щодо можливості появи зачатка залози на 6-у тижні пренатального розвитку. Перші ознаки закладки ПСЗ виявили в Зр 11,0 мм ТКД (40 діб), як потовщення Еп первинної ротової порожнини з появою так званої „епітеліальної пластинки” в ділянках щічно-альвеолярних (правої та лівої) кишень, що перекликається з даними В.Л. Быкова (2012), який зазначає, що ембріональний розвиток слинних залоз починається з появи зачатка, що має вигляд потовщення Еп ротової порожнини.

            Спираючись на результати власних досліджень, ми не підтримуємо як застарілих тверджень С.Н. Романюк (1971), О.В. Волковой и др. (1976), так і сучасних (Д.В. Проняєв та ін., 2013) щодо появи зачатка ПСЗ на межі 6-7 тижнів ВУР у Зр і Пп людини 12,0-14,8 мм ТКД.

            Отримані результати вносять корективи в матеріали тієї частини досліджень ембріогенезу ПСЗ (Б.М. Карлсон, 1983; V. Holibka, 1985), що наводять більш пізній термін її появи – на 7-8-у тижнях ембріогенезу.

            У поглядах на причини наведених розбіжностей щодо часу появи закладки ПСЗ ми підтримуємо висновок Е.Ю. Шаповаловой и др. (2010), які звертають увагу дослідників на те, що дані стосовно часу виокремлення різних зачатків людини в наукових джерелах перенасичені неточностями, а в багатьох випадках навіть суперечливі, що, очевидно, пов’язано з недосконалістю існуючих на сьогоднішній день періодизацій ембріогенезу і критеріїв визначення віку Зр.

            Наприкінці зародкового періоду (Зр 13,0 мм ТКД) закладка ПСЗ набуває вигляду суцільного Еп тяжа, який представлений компактно розміщеними Еп клітинами кубічної форми, що підтверджує думку Е.Ш. Герловина (1978) про те, що зачаток ПСЗ на самих ранніх етапах розвитку має вигляд єдиного Еп тяжа без просвіту.

            На 6-му тижні ембріогенезу в зачатках головного відділу Зр людини спостерігається посилена проліферація клітин Мх у периепітеліальних зонах і їхнє дивергентне диференціювання як у бік фібробластичного, так і остеогенного диферонів, що, на нашу думку, пов’язано з прискореним васкулогенезом цієї ділянки.

            У Зр 12,0-12,5 мм ТКД було вперше виявлено ускладнення біосинтезу полісахаридів (Пс) в агрегованих Еп зачатках ПСЗ. Активно депонуються Пс клітинами ущільненої прилеглої Мх.

            Аналіз кількісних цитофотометричних даних вмісту Пс у клітинах Мх досліджуваних структур у Зр 13,0 мм ТКД вказує на те, що біосинтез ШЙК-позитивних речовин, порівняно з попередніми віковими періодами, наприкінці зародкового періоду значно зростає (табл. 1), що передує виокремленню закладки ПСЗ та супроводжує формування первинного зачатка залози.