Методы функциональной экспрессии генов, кодирующих фармацевтически значимые гликопротеины Воробьев Иван Иванович

Краткое описание

Воробьев,ИванИванович.Методыфункциональнойэкспрессиигенов,кодирующихфармацевтическизначимыегликопротеины: диссертация ... доктора биологических наук : 03.01.04 /ВоробьевИванИванович; [Место защиты: Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук]. - Москва, 2019. - 264 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ИНСТИТУТ БИОИНЖЕНЕРИИ На правах рукописиВоробьевИванИвановичМЕТОДЫФУНКЦИОНАЛЬНОЙЭКСПРЕССИИГЕНОВ,КОДИРУЮЩИХФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЗНАЧИМЫЕГЛИКОПРОТЕИНЫ03.01.04

стр. 23
обезьяны SV40. Селекционный маркер находился после сигнала полиаденилирования EEF1A1, но перед 3’фланкирующим участкомгенаEEF1A1. Следствием такого расположенияфункциональныхучастков являлась невысокая генетическая сцепленность целевогогенаигенаселекционного маркера, предполсущественно ограничивающая возможность амплификации целевогогена. Предположительно, при проведении амплификации построенных по такой схеме экспрессионных кассет под действием

стр. 98
представленного в геноме клеток CHO только один раз, по поисковой выдаче алгоритма BLAST из базы данных NCBI Nucleotide Collection. Для расчета уровняэкспрессиимРНК использовали относительный ΔΔCqметоддля праймеров с известной эффективностью ПЦР. Относительное увеличение уровняэкспрессиигенав разах, нормированного по контрольномугену, определяли по формуле (1) или, в случаях, когда эффективность ПЦР не определялась или была близка к единице, по формуле

Оглавление диссертациидоктор наук Воробьев Иван Иванович
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Системы гетерологической экспрессии белков в клетках млекопитающих с высоким
выходом
2.1.1. Промышленно пригодные методы культивирования клеток млекопитающих
2.2. Фактор VII свертывания крови
2.3. Фактор VIII свертывания крови
2.3.1. Полноразмерный рекомбинантный фVШ
2.3.2. Рекомбинантный фVШ с делецией B-домена
2.3.3. Лекарственные препараты фVШ пролонгированного действия
2.3.4. Факторы, ограничивающие продуктивность систем гетерологической экспрессии фVШ
35
2.4. Фактор IX свертывания крови человека
2.4.1. Заместительная терапия гемофилии В
2.4.2. Рекомбинантный ф^К
2.4.3. Структура и пост-трансляционные модификации фИ
2.4.4. Улучшения процессов получения рекомбинантного ф^К
2.4.5. Возможности и ограничения методов получения ф^К в трансгенных организмах
2.4.6. Измененные варианты рекомбинантного ф^К для клинического применения
2.4.7. Потенциал и границы возможностей генотерапии гемофилии B
2.4.8. Возможные пути повышения продуктивности систем экспрессии ф^К в клетках CHO

2.5. Фолликулостимулирующий гормон человека
2.5.1. Биосинтез, секреция и транспорт ФСГ
2.5.2. Роль олигосахаридных групп в функционировании ФСГ
2.5.3. Рецептор ФСГ, общая схема передачи сигнала
2.5.4. Биологические функции ФСГ
2.5.5. Рекомбинантный ФСГ для клинического применения
2.5.6. Продуктивность существующих систем биосинтеза ФСГ и возможности по ее увеличению
2.6. Лютеинизирующий гормон человека
2.7. Конъюгаты полипептидов с полисиаловой кислотой как искусственные гликопротеиды
2.7.1. Способы химической модификации инсулина
2.7.2. Оксинтомодулин
3. Материалы и методы
3.1. Методы работы с ДНК
3.1.1. Общие методы работы с ДНК
3.1.2. Создание экспрессионных конструкций
3.1.3. Препаративное получение плазмид для трансфекции
3.2. Методы работы с бактериями Escherichia coli
3.3. Методы работы с культурами клеток млекопитающих
3.3.1. Трансфекция и культивирование транзиентно трансфицированных клеток
3.3.2. Получение стабильно трансфицированных клеток
3.3.3. Создание моноклональных линий-продуцентов
3.3.4 Клонирование методом предельных разведений
3.3.5. Получение клональных продуцентов ф1Х
3.3.6. Получение стабильно трансфицированных популяций клеток при использовании пар векторов с маркерами устойчивости DHFR и GS
3.4. Методы анализа продуцентов
3.4.1. Выделение геномной ДНК
3.4.2. Выделение РНК и получение кДНК
3.4.3. ПЦР в реальном времени
3.4.4. Саузерн-блот гибридизация
3.4.5. Иммуноферментный анализ
3.4.6. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ)
3.4.7. Количественное определение белка
3.4.8. Иммуноблоттинг
3.4.9. Изоэлектрическое фокусирование
3.4.10. Коагулометрия
3.4.11. Ферментативная кинетика
3.4.12. Измерение концентрации флуоресцентных белков и проточная цитофлуориметрия
3.4.13. Модификации состава культуральной среды при культивировании линии-продуцента фVШ
3.5. Очистка и характеризация продуктов
3.5.1. Хроматографическая очистка фVШ
3.5.2. Выделение и очистка ф1Х
3.5.3 Хроматографическая очистка ФСГ
3.5.4. Формулирование ФСГ-содержащего препарата
3.5.5. Определение примеси ДНК штамма-продуцента в очищенном препарате ФСГ
3.5.6. Определение родственных примесей (окисленных форм) в препарате ФСГ
3.5.7. Трипсинолиз ФСГ
3.5.8. Анализ сахаров
3.5.9. Резорциноловый метод определения сиаловой кислоты
3.5.10. Масс-спектрометрия
3.6. Получение мкАт
3.6.1. Получение мкАт к фУ11
3.6.2. Получение мкАт к фVШ
3.7.Компьютерное моделирование
3.8. Методы анализа ФСГ в фармацевтических композициях
3.9. Методы физико-химического анализа субстанции ФСГ
2.9.1 Определение первичной последовательности
3.9.2. Изучение вторичной и третичной структуры
3.9.3. Определение состава N-гликанов
3.9.4. Определение биологической активности in vitro
3.10. Методы исследования ФСГ in vivo
3.10.1. Определение биологической активности in vivo
3.10.2. Острая токсичность
3.10.3. Подострая токсичность
3.11. Методы проведения клинического исследования ФСГ
3.12. Получение конъюгата инсулина и полисиаловой кислоты
3.13. Получение конъюгата оксинтомодулина с полисиаловой кислотой
3.13.1. Синтез конъюгата OXM с полисиаловой кислотой
3.13.2. Получение очищенного конъюгата
3.13.3. Химическое десиалирование PSA-OXM
3.13.4. Пептидное картирование при помощи протеазы Asp-N
3.13.5. Ограниченный протеолиз при помощи протеазы DPP-IV
3.13.6. Определение активности PSA-OXM на животной модели
4. Результаты исследования
4.1. Создание линии клеток-продуцентов фактора VII в клетках линии BHK при помощи стандартной векторной плазмиды
4.2. Создание линии продуцента фактора VIII c делецией B-домена на базе стандартной
экспрессионной системы в клетках линии CHO
3.2.1. Создание экспрессионных конструкций делеционного мутанта фVШ
4.2.2. Получение и характеризация линии-продуцента BDD-фVШ
4.2.3. Получение мкАт для препаративной очистки фVШ
4.3. Дизайн генетических элементов для оригинальной системы экспрессии p
4.3.1. Получение минимального базового вектора pBL
4.3.2 Получение фланкирующих областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка
4.3.3. Получение экспрессионного вектора p
4.3.4. Проверка свойств вектора p1.1 для модельного белка eGFP
4.3.5. Получение совместимых c p1.1 экспрессионных векторов серии p1
4.4. Получение и характеризация линий-продуцентов BDD-фVШ на основе разработанной
системы экспрессии
4.4.1. Изменение условий культивирования для увеличения концентрации фVШ в среде
4.4.2 Очистка и характеризация BDD-фVШ
4.4.3. Компьютерное моделирование, поиск синтетического лиганда для очистки фVШ
4.5. Ко-экспрессия гена целевого белка и вспомогательных генов на примере фактора свертывания крови IX
4.5.1. Получение и характеризация первичных линий-продуцентов фИ
4.5.2. Ко-экспрессия генов PACE/furin и VKORC1
4.5.3. Характеризация линии клеток 3B12-86
4.5.4. Выделение и очистка ф!К
4.6. Ко-экспрессия пары генов, образующих гетеродимерный гликопротеин, при помощи трицистронного вектора, на примере ФСГ
4.6.1. Получение и характеризация клональных линий-продуцентов ФСГ
4.6.2. Получение очищенного ФСГ, пригодного для клинического применения
4.6.3. Характеризация очищенного ФСГ
4.6.4. Фармацевтическая композиция прототипа лекарственного средства ФСГ
4.6.5. Доклинические исследования субстанции ФСГ
4.6.6. Клиническое исследование лекарственного препарата ФСГ
4.7. Одновременная амплификация пары экспрессионных плазмид в геноме клеток-продуцентов. Получение продуцентов лютеинизирующего гормона
4.7.1. Возможность ко-амплификации пары плазмид на примере модельных флуоресцентных белков
4.7.2 Многостадийная ко-амплификация пары плазмид на примере лютеинизирующего гормона человека
4.8. Создание искусственных гликопротеидов методом химической конъюгации с полисиаловой кислотой
4.8.1. Получение чистого препарата конъюгата инсулина и полисиаловой кислоты
4.8.2. Конъюгат оксинтомодулина и полисиаловой кислоты
4.8.3 Определение точки конъюгации при помощи пептидного картирования
4.8.4. Определение чувствительности к DPP-IV
4.8.5. Влияние PSA-OXM на общее потребление пищи в краткосрочном тесте
4.9. Механизм взаимодействия каталитических антител с фосфороорганическими субстратами
5. Обсуждение результатов
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ