Получение мутантных форм фоторецепторного белка рековерина по его Ca2+-связывающим доменам методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза и исследование их функциональных свойств Алексеев, Андрей Михайлович

Краткое описание

Алексеев,АндрейМихайлович.ПолучениемутантныхформфоторецепторногобелкарековеринапоегоCa2+-связывающимдоменамметодомолигонуклеотид-направленногомутагенезаиисследованиеихфункциональныхсвойств: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Пущино, 1999. - 103 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.ШЕМЖИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА На правах рукописиАЛЕКСЕЕВАНДРЕЙМИХАЙЛОВИЧПОЛУЧЕНИЕМУТАНТНЫХФОРМФОТОРЕЦЕПТОРНОГОБ Е Ж АРЕКОВЕРИНАПОЕГОСа ^^-СВЯЗЫВАЮЩИМДОМЕНАММЕТОДОМОЛИГОЕУКЛЕОТИД-НАПРАВЛЕННОГОМУТАГЕНЕЗАИИССЛЕДОВАНИЕИХФУНКЦИОНАЛЬНЫХСВОЙСТВ03.00.04-Биохимия Диссертация на соискание...

стр. 3
Сайт-направленныймутагенезЕР4 77 3.2.2. Экспрессия, выделение и очистка мутантоврековеринас измененными Са^"^-связывающимиучастками 79 3.3. Характеристика ифункциональныесвойствамутантоврековерина, модифицированных поегоСа^^ -связывающимучасткам 83 3.3.1. Связывание Са^"^мутантнымиформамирековерина84 3.3.2. Связываниемутантныхформрековеринас 85...

стр. 64
считать, что возможной мишенью длярековеринав НСП является родопсинкиназа [201]. Настояш;ееисследованиерековеринапроводились по следующим основным направлениям: прямая экспрессиярековеринав E.coli и доказательство идентичностисвойствприродного и полученного рекомбинантногорековерина;получениеметодомолигонуклеотид-направленногомутагенезамутантоврековеринапоегоСа^'^-связывающим...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Алексеев, Андрей Михайлович
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в E.coli
1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков
1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов
1.2.1. Промоторы
1.2.2.Терминаторы транскрипции
1.2.3. Антитерминаторы транскрипции
1.2.4. Строго регулируемые системы экспрессии
1.3. Регуляция на уровне трансляции
1.3.1. Инициация трансляции мРНК
1.3.2. Энхансеры трансляции
1.3.3. Стабильность мРНК
1.3.4. Терминация трансляции
1.4. Пространственная локализация экспрессированного белка в E.coli
1.4.1. Цитоплазматическая экспрессия
1.4.2. Экспрессия в периплазму
1.5. Гибридные белки
1.6. Молекулярные шапероны
1.7. Синонимические замены аминокислотных остатков
1.8. Протеолиз белка в процессе экспрессии белка
1.9. Выбор питательных сред и условий ферментации
1.10. Заключение
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Ферменты
2.3. Методы
2.3.1. Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток
2.3.1.1. Выращивание ночной культуры Е. coli
2.3.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.3.2. Выделение одноцепочечной формы фагаМ13шр19
2.3.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина
2.3.4. Мутагенез с помощью ПЦР, метод мегапраймера
2.3.5. Получение компетентных клеток E.coli
2.3.6. Трансформация клеток Е.coli
2.3.6.1. Трансформация клеток E.coli штамма XL-1 вектором М13шр19, несущим мутантную кДНК рековерина
2.3.6.2. Трансформация клеток Е.coli плазмидной ДНК
2.3.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.3.8. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН
2.3.9. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа
2.3.10. Выделение мутантных форм рекомбинантного рековерина
2.3.11. Аналитические процедуры
2.3.11.1. Определение концентрации белков
2.3.11.2. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование и экспрессия гена рековерина
3.1.1. Выделение и идентификация полноразмерного гена рековерина.

3.1.2. Клонирование и экспрессия гена рековерина
3.1.2.1. Клонирование гена рековерина
3.1.2.2. Экспрессия гена рековерина и характеристика полученного рекомбинантного препарата рековерина
3.1.3. Получение миристоилированного рекомбинантного рековерина.

3.1.3.1. Коэкспрессия генов рековерина и миристоилтрансферазы
3.1.3.2. Сравнение свойств природного и миристоилированного рекомбинантного рековерина
3.2. Клонирование, экспрессия и выделение мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+-связывающим участкам
3.2.1. Сайт-направленный мутагенез рековерина по его Са2+-
связывающим участкам
3.2.1.1. Сайт-направленный мутагенез ЕБ2 и ЕРЗ
3.2.1.2. Сайт-направленный мутагенез одновременно по ЕБ2 и ЕБЗ
3.2.1.3. Сайт-направленный мутагенез ЕР4
3.2.2. Экспрессия, выделение и очистка мутантов рековерина с
измененными Са - связывающими участками
3.3. Характеристика и функциональные свойства мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+ - связывающим участкам
3.3.1. Связывание Са2+ мутантными формами рековерина
3.3.2. Связывание мутантных форм рековерина с
фоторецепторными мембранами
3.3.3. Функциональная активность мутантов рековерина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список принятых сокращений
кДНК комплементарная ДНК
ДСН додецилсульфат натрия
ИПТГ изопропил-/?-тиогалактозид
НСП наружный сегмент палочек
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА этиленгликоль-бис/|3-аминоэтиловый эфир
тетрауксусной кислоты
O-i- о I
[Са ]f свободная концентрация ионов Са
EFl, EF2, EF3 и EF4 соответственно, первый - четвертый Са -
связывающие участки рековерина -EF2, -EF3, -EF2,3 соответственно, мутантные формы рековерина
с "испорченными" участками EF2, EF3 и одновременно EF2 и EF3 +EF4 мутантная форма с "восстановленным"
участком EF4
nRc и mRc соответственно, рекомбинантный
немиристоилированный и миристоилированный рековерин Rh родопсин
RK родопсинкиназа
SspA фрагмент белка А из Staphylococcus aureus