Противоопухолевое действие некоторых низкомолекулярных соединений из морских беспозвоночных Дышловой Сергей Анатольевич

Краткое описание

Дышловой,СергейАнатольевич.Противоопухолевоедействиенекоторыхнизкомолекулярныхсоединенийизморскихбеспозвоночных: диссертация ... доктора биологических наук : 03.01.04 /ДышловойСергейАнатольевич; [Место защиты: Тихоокеан. ин-т биоорган. химии ДВО РАН]. - Владивосток, 2018. - 277 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Российской академии наук На правах рукописиДышловойСергейАнатольевичПротивоопухолевоедействиенекоторыхнизкомолекулярныхсоединенийизморскихбеспозвоночных03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: Доктор химических наук Академик РАН

стр. 11
молекулярных механизмов физиологическогодействияс целью получения новых веществ с уникальной биологической активностью, в том числепротивоопухолевой, являются актуальными. Настоящая работа посвящена изучению особенностей физиологическогодействиясерии природныхсоединений, полученных изморскихгубок, асцидий, голотурий и другихморскихбеспозвоночныхи проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток человека. Все эти...

стр. 245
настоящей работы была изучена большая сериянизкомолекулярныхметаболитов, выделенных изнекоторыхморскихбеспозвоночных. В результате были идентифицированы двасоединения, фрондозид А и ризохалинин, проявляющие достоверноепротивоопухолевоедействиев условиях экспериментов in vivo на бестимусных мышах,

Оглавление диссертациидоктор наук Дышловой Сергей Анатольевич
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Педерины, оннамиды и микаламиды
2.2. Гуанидиновые алкалоиды из морской губки Monanchora pulchra
2.3. Тритерпеновые гликозиды голотурий
2.4. «Двухголовые» (биполярные) сфинголипиды морских губок
2.5. Терминальные опухолевые клетки
2.5.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток
2.5.2. Цисплатин-устойчивые клеточные линии GCT
2.6. Рак простаты
2.7. Лимфома Бёркитта
2.8. Рак мочевого пузыря
2.9. Клетки JB6 P+C141 - модель для изучения канцеропревентивных веществ
2.10. Апоптоз
2.10.1. Каспаза-зависимый апоптоз
2.10.2. Каспаза-независимый апоптоз
2.11. Аутофагия
2.12. Исследование эффекта комбинирования препаратов
2.13. Протеомика и методы, применяемые в ней
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. In vitro скрининг низкомолекулярных соединений, выделенных из морских беспозвоночных, на цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток
3.1.1. Определение цитотоксической активности
3.2. Исследование микаламида А из асцидии Polysincraton sp
3.2.1. Выделение и установление структуры микаламида А из морской асцидии Polysincraton sp
3.2.2. Исследование противоопухолевой in vitro активности микаламида А и механизмов её реализации
3.2.2.1. Исследование способности микаламида А предотвращать EGF-индуцируемую злокачественную трансформацию клеток JB6 P+ Cl41 и колониеобразование опухолевых клеток HeLa
3.2.2.2. Апоптоз-индуцирующая активность микаламида А
3.2.2.3. Эффект микаламида А на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NF-kB и p53 в клетках JB6 C141
3.2.2.4. Исследование влияния микаламида А на MAPK p38, JNK1/2 и ERK1/2
3.2.2.5. Обсуждение результатов исследования биологической активности микаламида А
3.3. Исследование противоопухолевой in vitro активности гуанидиновых алкалоидов морской губки Monanchora pulchra
3.3.1. Исследование цитотоксической активности и механизмов действия монанхоцидина А (Mc-A) на моделях лекарственно-устойчивых терминальных опухолевых клеток
3.3.1.1. Исследование цитотоксической активности Mc-A
3.3.1.2. Эффект Mc-A на прогрессию клеточного цикла и экспрессию маркеров апоптоза в опухолевых клетках
3.3.1.3. Индукция неспецифической белковой деградации под действием Mc-A на опухолевые клетки
3.3.1.4. Индукция цитотоксической аутофагии опухолевых клеток NCCIT-R под действием Mc-A
3.3.1.5. Индукция пермеабилизации лизосомных мембран (ПЛМ) опухолевых клеток под действием Mc-A
3.3.1.6. Обсуждение результатов исследования in vitro цитотоксической активности Mc-A на опухолевые клетки человека
3.3.1.7. Исследование эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT-R
3.3.1.7.1. Выявление белков, регулируемых под действием Mc-A в клетках NCCIT-R
3.3.1.7.2. Биоинформатический анализ протеомных данных
3.3.1.7.3. Валидация регуляции белков, открытых методом протеомики
3.3.1.7.4. Валидация предсказанного ингибирующего эффекта Mc-A на миграцию и колониеобразование клеток NCCIT-R
3.3.1.7.5. Обсуждение результатов анализа эффекта Mc-A на протеом клеток NCCIT-
3.3.2. Исследование in vitro канцеропревентивной и цитотоксической активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra на клетках JB6 Cl41 и HeLa
3.3.2.1. Исследование in vitro канцеропревентивной активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra
3.3.2.2. Исследование эффекта алкалоидов 11, 12, 18-20 и 23 на MAPK/AP-1 сигналинг
3.3.2.3. Исследование эффекта гуанидиновых алкалоидов на транскрипционную активность белка p53
3.3.2.4. Эффект алкалоидов 11, 12, 17-20, 23 и 27 на индукцию программируемой клеточной смерти, а также ареста клеточного цикла опухолевых клеток HeLa
3.3.2.5. Обсуждение результатов исследования in vitro канцеропревентивной и цитотоксической активности гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra
3.4. Исследование противоопухолевой активности тритерпенового гликозида фрондозида А (FrA) из кукумарии Cucumaria okhotensis
3.4.1. Исследование активности FrA на моделях рака простаты
3.4.1.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность, способность к пролиферации, а также колониеобразование клеток рака простаты
3.4.1.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла и индукцию апоптоза клеток рака простаты
3.4.1.3. Эффект FrA на экспрессию некоторых про- и антиапоптотических белков в клетках рака простаты
3.4.1.4. Эффект FrA на цитопротекторную аутофагию в клетках рака простаты
3.4.1.5. Выявление белков, регулируемых в клетках PC-3 под действием цитотоксических концентраций FrA, с помощью методов протеомики
3.4.1.6. Анализ экспрессии открытых с помощью 2D-PAGE белков методами 1D- и 2Б-Вестерн-блоттинга
3.4.1.7. Анализ возможных взаимодействий регулируемых под действием FrA белков
3.4.1.8. In vivo активность FrA на моделях рака простаты человека
3.4.1.8.1. Эффект FrA на рост первичных опухолей и формирование метастазов
3.4.1.8.2. Исследование побочных эффектов применения FrA in vivo
3.4.1.9. Обсуждение результатов экспериментов по воздействию FrA на опухолевые клетки рака простаты человека
3.4.2. Исследование активности FrA на моделях уротелиальной карциномы человека
3.4.2.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток уротелиальной карциномы человека
3.4.2.2. Исследование апоптоз-индуцирующего эффекта FrA в клетках уротелиальной карциномы человека
3.4.2.3. Исследование роли каспаз в FrA-индуцируемом апоптозе
4
3.4.2.4. Исследование эффекта FrA на MAPK в клетках RT112
3.4.2.5. Исследование эффекта FrA на аутофагию в клетках уротелиальной карциномы
3.4.2.6. Исследование комбинированного действия FrA с цисплатином или гемцитабином на клетки уротелиальной карциномы человека
3.4.2.7. Обсуждение результатов исследования эффекта FrA на клетки уротелиальной карциномы человека
3.4.3. Исследование активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта
3.4.3.1. Исследование эффекта FrA на жизнеспособность клеток лимфомы Бёркитта
3.4.3.2. Эффект FrA на прогрессию клеточного цикла клеток лимфомы Бёркитта
3.4.3.3. Исследование способности FrA индуцировать каспаза-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта
3.4.3.4. Исследование эффекта FrA на митохондрии и транслокацию AIF в клеточное ядро
3.4.3.5. Исследование роли белка p53 в FrA-индуцируемом апоптозе клеток лимфомы Бёркитта
3.4.3.6. Действие FrA на аутофагию в клетках лимфомы Бёркитта
3.4.3.7. Обсуждение результатов исследования активности FrA на моделях лимфомы Бёркитта
3.5. Исследование противоопухолевой активности ризохалинина (Rhiz) и его производных на моделях рака простаты человека
3.5.1. Исследование эффектов Rhiz in vitro
3.5.1.1. Исследование способности Rhiz ингибировать жизнеспособность клеток рака простаты человека
3.5.1.2. Исследование апоптоз-индуцирующей активности Rhiz в клетках рака простаты человека
3.5.1.3. Исследование эффекта Rhiz на аутофагию в клетках рака простаты
3.5.1.4. Исследование эффекта Rhiz на потенциал-зависимые калиевые каналы
3.5.1.5. Эффект Rhiz на AR-сигналинг в клетках рака простаты
3.5.1.6. Исследование эффекта Rhiz в комбинации с доцетакселем и кабазитакселем, а также с энзалутамидом при действии на AR-V7-положительные клеткам
3.5.2. Исследование эффекта Rhiz in vivo
3.5.2.1. Подбор дозы Rhiz для испытаний in vivo
3.5.2.2. Эффект на Rhiz рост первичных опухолей и индукцию апоптоза опухолевых
клеток in vivo
3.5.2.3. Исследование побочных эффектов Rhiz in vivo
3.5.3. Обсуждение результатов исследования противоопухолевой активности Rhiz на моделях рака простаты человека
3.5.4. Исследование эффекта Rhiz на протеом клеток рака простаты человека
3.5.4.1. Выявление белков, регулируемых под действием Rhiz на клетки PC-3
3.5.4.2. Биоинформатический анализ полученных данных
3.5.4.3. Валидация регулируемых белков, открытых методом протеомики
3.5.4.4. Способность Rhiz ингибировать миграцию опухолевых клеток PC-3
3.5.4.5. Исследование цитопротекторной роли киназы ERK1/2 в клеточном ответе на действие Rhiz
3.5.4.6. Обсуждение результатов исследования эффекта Rhiz на протеом клеток рака простаты человека
3.5.5. Исследование активности синтетических производных ризохалина
3.5.5.1. Исследование цитотоксической активности синтетических производных ризохалина
3.5.5.2. Исследование эффекта синтетических производных ризохалина на прогрессию клеточного цикла
3.5.5.3. Проапоптотическая активность синтетических производных ризохалина
3.5.5.4. Эффект синтетических производных ризохалина in vitro на аутофагию
3.5.5.5. Эффект синтетических производных ризохалина на сигналинг андрогенового рецептора in vitro
3.5.5.6. Обсуждение результатов исследования эффектов синтетических производных ризохалина in vitro
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Приборы и материалы
4.1.1. Приборы
4.1.2. Реагенты
4.1.3. Клеточные культуры
4.1.4. Выделение исследуемых веществ
4.1.4.1. Общая информация
4.1.4.2. Сбор биологического материала и выделение микаламида А
4.2. Стандартные методики для определения биологической активности веществ
4.2.1. Растворы веществ, используемые в экспериментах по исследованию биологической активности
4.2.2. Определение цитотоксической активности веществ методом MTS или МТТ
4.2.3. Определение способности веществ влиять на пролиферацию клеток (метод с использованием красителя трипанового синего)
4.2.4. Определение канцеропревентивной активности веществ
4.2.5. Определение способности веществ ингибировать колониеобразование опухолевых клеток в мягком агаре
4.2.6. Определение способности веществ ингибировать формирование и рост колоний опухолевых клеток на твёрдой подложке
4.2.7. Люциферазный метод определения AP-1-, NFkB- и р53-зависимой транскрипционной активности
4.2.8. Приготовление белковых экстрактов для 1D- и 2D-Вестерн-блоттинга, а также 2D-PAGE
4.2.9. Определение концентрации белка (метод Бредфорд)
4.2.10. Вестерн-блоттинг
4.2.11. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE)
4.2.12. Анализ рисунков 2D-гелей
4.2.13. Идентификация белков методом масс-спектрометрии
4.2.14. Двумерный Вестерн-блоттинг (2D-Вестерн-блоттинг)
4.2.15. Анализ экспрессии простатического специфического антигена (PSA)
4.2.16. Исследование синергического, аддитивного или антагонистического эффекта веществ при их комбинировании
4.2.17. Исследование антагонистического эффекта SP600125 (ингибитора JNK1/2)
4.2.18. Окрашивание одномерных SDS-полиакриламидных гелей красителем кумасси бриллиантовым синим G
4.2.19. Исследование белков, содержащихся в образцах 1 и 2, методом масс-спектрометрии (см. 3.3.1.3.)
4.2.20. Определение активированной каспазы-3 с помощью FACS
4.2.21. Окрашивание лизосом красителем акридиновым оранжевым
4.2.22. Измерение выхода катепсина B в межклеточное пространство
4.2.23. Клеточное фракционирование
4.2.24. Полимеразно-цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)
4.2.25. Метод проточной цитометрии для исследования способности веществ
индуцировать апоптоз
7
4.2.26. Метод проточной цитометрии для исследования влияния веществ на клеточный
цикл
4.2.27. Исследование эффекта вещества на клеточную миграцию
4.2.28. Биоинформатический анализ протеомных данных
4.2.29. Подавление экспрессии гена р53 посредством трансфекции с использованием малых интерферирующих РНК ^ЯКА)
4.2.30. Световая микроскопия
4.2.31. Иммуноцитохимический метод и флуоресцентная микроскопия
4.2.32. Электронная микроскопия
4.2.33. Модели подкожных мышиных ксенографтов
4.2.34. Оценка роста опухолей и формирования метастазов
4.2.35. Оценка количества диссеминированных опухолевых клеток, а также циркулирующих опухолевых клеток при помощи Л/и-ПЦР
4.2.36. Анализ крови животных
4.2.37. Статистическая обработка полученных данных
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ