Шувалова Надія Сергіївна Оптимізація кисневого стану для культивування мезенхімальних стовбурових клітин з пупкового канатика людини

Краткое описание

Шувалова Надія Сергіївна, науковий співробітник відділу генних технологій ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України». Назва дисертації: «Оптимізація кисневого стану для культивування мезенхімальних стовбурових клітин з пупкового канатика людини». Шифр та назва спеціальності 03.00.20 біотехнологія. Спецрада Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики

Інститут молекулярної біології і генетики
Національної академії наук України
Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису
ШУВАЛОВА НАДІЯ СЕРГІЇВНА
УДК. 576.533+57.085.23
ДИСЕРТАЦІЯ
ОПТИМІЗАЦІЯ КИСНЕВОГО СТАНУ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН З ПУПКОВОГО
КАНАТИКА ЛЮДИНИ
03.00.20 біотехнологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей, результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело Н.С. Шувалова.
Науковий керівник: Кордюм Віталій Арнольдович, доктор біолоігчних наук, професор, член-кореспондент НАН України
Київ - 2021

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ 18
ВСТУП 20
РОЗДІЛ 1
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 27
1.1. Мезенхімальні стовбурові клітини - субпопуляція стовбурових клітин дорослого організма.
1.1.1 МСК з пупкового канатика людини 28
1.2.Осоливості та проблеми культивування МСК 30
1.2.1 Проблема деградації культури при мультиплікації в умовах
in vitro 32
1.3. Концентрація кисню в тканинах організму ссавців 32
1.3.1. Молекулярні механізми чутливості до концентрації кисню 34
1.3.2. Кисень як регулятор життєдіяльності ніші стовбурових клітини 37
1.3.3. Фізіологічні концентрації кисню як сучасний підхід до збереження
терапевтичних властивостей МСК 40
1.4. Деякі аспекти культивування МСК за фізіологічних концентрацій
кисню 40
1.4.1. Вплив умов помірної гіпоксії на проліферацію МСК 40
1.4.2. Вплив на морфологію, диференціацію та старіння 42
1.4.3. Вплив умов помірної гіпоксії на здатність до міграції та особливості
експресії молеклярних факторів 45
1.5. Біологічні ефекти інертних газів 46
РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ 50
2.1. Опис біологічних, хімічних агентів та обладнання що використовувались
у роботі 50
2.1.1. Біологічні матеріали 50
2.1.2. Хімічні агенти 50
2.1.3. Обладнання 51
2.2. Отримання та характеристика первинної культури МСК-ВС 52
2.2.1. Отримання первинної культури МСК-ВС 52
2.2.2. Характеристика поверхневих маркерних білків 52
2.2.3. Аналіз здатності до диференціації 53
2.2.4. Оцінка метаболічної активності культури МСК-ВС 53
2.2.5. Морфологічний аналіз клонів в первинній культурі МСК-ВС 53
2.3. Гістологічне дослідження тканини ВС 54
2.4. Створення газових сумішей із заданими характеристиками та
культивування МСК-ВС в умовах помірної гіпоксії 55
2.4.1. Дослідження проліферативних характеристик МСК-ВС за умов
помірної гіпоксії 56
2.5. Отримання субпопуляцій МСК шляхом збереження клітин, що
спонтанно відкріпились 57
2.6. Аналіз морфології культур МСК-ВС 57
2.6.1. Фіксація та забарвлення культур МСК-ВС (виготовлення препаратів
МСК-ВС) 58
2.6.2. Морфометричний аналіз препаратів культур МСК-ВС 58
2.6.3. Оцінка активності бета-галактозидази, асоційованої зі старінням 59
2.7. Трансфекція МСК-ВС 60
2.7.1. Виділення ДНК лужною методикою 60
2.7.2. Приготування препарату для трансфекції 60
2.7.3. Трансфекція МСК-ВС при фізіологічних концентраціях кисню 61
2.8. Статистична обробка даних 61
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 63
3.1. Розробка системи створення газових сумішей 63
3.1.1. Схема приладу для створення газових сумішей 63
3.2. Оптимизація методу отримання культури МСК-ВС 71
3.2.1. Оптимізація введення МСК-ВС у культуру за стандартних умов 71
3.2.2. Отримання культур МСК-ВС за умов помірної гіпоксії 78
3.3. Аналіз проліферації культур МСК-ВС при фізіолоігчних концентраціях кисню 83
3.3.1. Дослідження проліферації неімморталізованих ліній МСК-ВС,
пасованих за стандартними методиками 84
3.3.2. Дослідження експресії поверхневих маркерних білків при
культивуванні в умовах помірної гіпоксії 87
3.3.3. Дослідження проліферації МСК-ВС, отриманих за допомогою
збереження клітин, які спонтанно відкріпились 89
3.3.3.1. Харакетристика методу отримання культур МСК-ВС за допомогою
збереження клітин, що спонтанно відкріпились 90
3.3.3.2. Дослідження проліферації культур МСК-ВС, отриманих за
допомогою збереження спонтанно відкріплених клітин, в умовах фізіологічних концентрацій кисню 93
3.4. Дослідження морфологічних особливостей культур МСК-ВС,
культивованих при фізіологічних концентраціях кисню 97
3.4.1. Морфометричні дослідження культур МСК-ВС на різних пасажах, при
фізіологічних концентраціях кисню 97
3.4.2. Оцінка процесів старіння у культурах МСК-ВС 101
3.5. Оптимізація трансфекції МСК за допомогою культивування в умовах
помірної гіпоксії 105
РОЗДІЛ 4. УЗАГАЛЬНЕННЯ ТА АНАЛІЗ
ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ 112
ВИСНОВКИ 126
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 128
ДОДАТОК А 149

Список литературы

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі отримані нові данні стосовно впливу культивування в умовах фізіологічних концентрацій кисню у газових сумішах на основі азоту та аргону на функціональні та морфологічні характеристики МСК-ВС.
1. Розроблено схеми створення сумішей зі зниженим вмістом кисню на основі аргону та азоту, перевірено експериментальні зразки розроблених систем. Оптимізовано методичний підхід для культивування МСК-ВС у створених за допомогою систем умовах помірної гіпоксії.
2. Встановлено, що введення МСК-ВС в культуру методом експлантів за фізіологічних концентрацій кисню (3%) сприяє збільшенню кількості отриманих клітин, незалежно від особливостей тканини Вартонова студня.
3. Показано, що культивування МСК-ВС за 3% кисню, як в суміші на основі азоту, так і в суміші на основі аргону підвищує рівень проліферації МСК-ВС. Культивування у газових сумішах з фізіологічним вмістом кисню не впливає на рівень експресії поверхневих маркерів. Вперше виявлено різницю у впливі газових сумішей на основі та аргону.
4. Встановлено, що культивування МСК в газових сумішах, що містять 3% кисню, призводить до зниження гетерогенності клітинної культури в ході її пасування, і зниження кількості клітин з фенотипом, притаманним старіючим клітинам, у порівнянні з культивуванням у стандартних умовах СО2-інкубатора. Встановлено, що в суміші на основі азоту ступінь гетерогенності і кількість МСК-ВС із фенотипом, характерним для старіючих клітин, були найнижчими.
5. Вперше показано, що культивування МСК-ВС у газових сумішах зі зниженим містом кисню сприяє підвищенню ефективності трансфекції таких клітин плазмідною ДНК. Відсоток eGFP-позитивних клітин, був більшим в середньому у 2,58 в суміші на основі азоту, та 1,37 рази в суміші на основі
аргону, у порівнянні з умовами СО2-інкубатора.
Вперше виявлено різницю у біологічних ефектах сумішей з однаковим вмістом кисню, створених на основі азоту або аргону, на проліферативні і морфологічні особливості та ефективність невірусної трансфекції МСК-ВС.