Сравнительный анализ экспрессии гетерологичных генов в дрожжах Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и изучение условий повышения продукции рекомбинантных белков Падкина, Марина Владимировна

Краткое описание

Падкина,МаринаВладимировна.СравнительныйанализэкспрессиигетерологичныхгеноввдрожжахSaccharomycescerevisiaeиPichiapastorisиизучениеусловийповышенияпродукциирекомбинантныхбелков: диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.15. - Санкт-Петербург, 2005. - 394 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
71:06-3/127 САНКТ-НЕТЕРБУРГСКИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописи НадкинаМаринаВладимировнаСРАВНИТЕЛЬНЫЙАНАЛИЗЭКСНРЕССННГЕТЕРОЛОГИЧНЫХГЕНОВВДРОЖЖАХSACCHAROMYCESCEREVISIAEИPICHIAPASTORISИИЗУЧЕНИЕУСЛОВИЙНОВЫШЕНИЯ НРОДУКЦНИ РЕКОМБННАНТНЫХБЕЛКОВ03.00.15 - генетика Президиум ВАК России^ j пр11сул>1л у^клтузо степень Д О х ация на соискание...

стр. 14
белкамии только в процессе секреции принимают правильную конформацию. Целью работы являетсясравнительноеизучениеэффективности функционирования системэкспрессиигетерологичныхгеновудрожжейSaccharomycescerevisiaeиPichiapastorisи исследование влияния различных факторов напродукциюрекомбинантныхбелков. 15 В задачи исследования входит: • создание векторовэкспрессии,...

Оглавление диссертациидоктор биологических наук Падкина, Марина Владимировна
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ДРОЖЖЕЙ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).
1.1. Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
1.1.1. Векторы экспрессии дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
1.1.2. Структура промоторов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
1.1.3. Промоторы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии.
1.1.3.1. Промоторы генов, кодирующих гликолитические ферменты.
1.1.3.2. Регулируемые промоторы.
Промотор гена ADH2.
Промоторы G^L-генов.
Промотор гена РН05.
Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04.
Белки регуляторы, кодируемые генами РН080 и РН
Белок, кодируемый геном РН081.
1.1.4. Терминаторы транскрипции генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии.
1.1.5. Зависимость уровня гетерологичной экспрессии от эффективности основных матричных процессов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
1.1.5.1. Транскрипция.
Роль DAS и DRS регуляторных последовательностей в эффективности транскрипции у дрожжей.
Элонгация транскрипции.
Терминация транскрипции.
Сплайсинг матричной РНК.
1.1.5.2. Стабильность матричной РНК.
1.1.5.2. Трансляция.
Инициация трансляции.
Элонгация трансляции.
Терминация трансляции.
1.1.6. Сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и шапероны.
1.1.7. Посттрансляционная модификация белков.
1.1.7.1. Удаление N-концевого метионина.
1.1.7.2. Ацетилирование N-концевой аминокислоты.
1.1.7.3. Фосфорилирование, N-миристоилирование и фарнезилирование белков.
1.1.8. Стабильность гетерологичных белков.
1.1.8.1. АТФ-зависимый протеолиз с участием убиквитина.
Сигналы деградации белков.
1.1.8.2. Неспецифический АТФ-независимый протеолиз в вакуолях.
1.1.9. Секреция чужеродных белков.
1.1.9.1. Сигнальные последовательности.
1.1.9.2. Протеолиз секреторных белков.
1.1.9.3. Гликозилирование секреторных белков.
1.1.9.4. Фолдинг секреторных белков.
1.2. Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Pichiapastoris.
1.2.1. Особенности метаболизма метилотрофных дрожжей.
1.2.2. Промоторы генов дрожжей Pichia pastoris, используемые в биотехнологии.
1.2.2.1. Промотор гена ЛОХ/.
1.2.2.2. Промотор гена GAP.
1.2.2.3. Промотор гена FLD1.
1.2.2.4. Промоторы генов РЕХ8, YPT1.
1.2.3. Векторы экспрессии дрожжей Pichia pastoris.
1.2.4. Секреция гетерологичных белков.
1.2.4.1. Сигнальные последовательности.
1.2.4.2. Протеолиз секреторных белков.
1.2.4.3. Гликозилирование секреторных белков.
1.2.4.4. Формирование дисульфидных связей и внутриклеточный транспорт секреторных белков.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Штаммы.
2.1.2. Плазмиды.
2.1.3. Условия культивирования штаммов.
2.2. Методы.
2.2.1. Трансформация бактерий и дрожжей.
2.2.2. Выделение ДНК.
2.2.3. Методы молекулярного клонирования.
2.2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.2.6. Электрофорез фрагментов ДНК.
2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.
2.2.8. Определение концентрации белка.
2.2.9. Электрофорез белков в ПААГ.
2.2.10. Дегликозилирование белков.
2.2.11. Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами.
2.2.12. Иммуноферментный анализ.
2.2.13. Определение биологической активности ИФН и ИЛ-2.
2.2.14. Определение активности кислых фосфатаз.
2.2.15. Определение константы Михаэлиса.
2.2.16. Ионообменная хроматография изозимов Кф на ДЭАЭ-целлюлозе
2.2.17. Гель-фильтрация Кф, рекомбинантных ИФН и HBsAg.
2.2.18. Выделение митохондриальной фракции из клеток дрожжей.
2.2.19. Определение активности цитохром С-оксидазы.
2.2.20. Определение активности Р-галактозидазы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание системы экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3.1.1. Изучение изозимного состава кислой фосфатазы дрожжей -сахаромицетов.
3.1.2. Зависимость синтеза Кф2 от уровня белков активаторов.
3.1.3. Создание штаммов-суперпродуцентов кислых фосфатаз.
3.2. Клонирование генов фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка под контролем промотора гена РН05 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3.2.1. Получение рекомбинантной плазмиды pHBI.
3.2.2. Влияние генотипа штамма-продуцента на продукцию фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка.
3.2.3. Выделение фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3.2.4. Выяснение причин токсичности Р-ИФН человека для клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3.2.4.1. Влияние рекомбинантного Р-ИФН на синтез белка теплового шока Hsp82p.
3.2.4.2. Изучение влияния мутацийpho80 иpho85 на жизнеспособность штаммов-продуцентов Р-ИФН человека.
3.2.4.3. Влияние рекомбинантного Р-ИФН и мутаций в гене РН085 на активность цитохром С-оксидазы.
3.3. Клонирование генов интерферонов человека и животных, гена интерлейкина-2 человека под контролем промотора гена АОХ1 дрожжей Pichia pastoris.
3.3.1. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с мутациями в генах, гомологичных генам ADE2 и РН085 дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
3.3.2. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с дизрупцией гена РЕР
3.3.3. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих Р-ИФН человека.
3.3.3.1. Создание вектора экспрессии pHIF.
3.3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного гена/FM?./ человека.
3.3.3.3. Создание вектора экспрессии pHIF2, обеспечивающего синтез нативного Р-ИФН человека.
3.3.3.4. Получение интегрантов дрожжей, несущих плазмиды pHIF и pHIF
3.3.3.5. Оценка продуктивности штаммов 4-GS115/pHIF и 4-GS115/pHIF
3.3.3.6. Определение углеводного компонента рекомбинантного Р-ИФН человека, секретируемого дрожжами Pichia pastoris.
3.3.4. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного Р-ИФН человека.
3.3.4.1. Создание вектора экспрессии pHIVB.
3.3.4.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного Р-ИФН человека штаммом 4-GS115/рШУВ.
3.3.5. Создание штаммов дрожжей Pichiapastoris, синтезирующих и секретирующих а16-ИФН человека.
3.3.5.1. Создание вектора экспрессии pHIN.
3.3.5.2. Получение штамма-продуцента а16-ИФН человека и оценка его продуктивности.
3.3.6. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих у-ИФН быка.
3.3.6.1. Создание вектора экспрессии pPIC9(IFN-y).
3.3.6.2. Получение штамма-продуцента у-ИФН быка и оценка его продуктивности.
3.3.7. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка.
3.3.8. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих интерлейкин-2 человека.
3.3.9. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных секреторных интерферонов.
3.3.10. Разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р-ИФН человека, секретируемых клетками дрожжей Pichia pastoris.
3.4. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов синтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы.
3.4.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б.
3.4.2. Получение интегрантов дрожжей Pichia pastoris, содержащих в геноме ген STX1B и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б.
3.4.3. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный синтаксин Б.
3.5. Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В, под контролем промотора гена АОХ1.
3.5.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного HBsAg adw и ayw серотипов.
3.5.2. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный HBsAg.
3.5.3. Получение штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного HBsAg.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков.
Влияние структуры лидерной области мРНК и присутствия редких кодонов на продукцию гетерологичных белков.
Посттрансляционная модификация гетерологичных белков.
Влияние особенностей метаболизма дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris на фолдинг рекомбинантных белков.
Стабильность гетерологичных белков.
Влияние гетерологичных белков на жизнедеятельность клетки дрожжей
Секреция гетерологичных белков.
Продукция синтаксина Б и HBsAg.
Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов.
Выделение и очистка гетерологичных белков.