Участие тирозиновой протеинфосфатазы SHP-1 в передаче сигнала от рецептора инсулина Кривцов, Андрей Владимирович

Краткое описание

Кривцов,АндрейВладимирович.УчастиетирозиновойпротеинфосфатазыSHP-1впередачесигналаотрецептораинсулина: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Москва, 1999. - 120 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС МЗ РФ На правах рукописиКРИВЦОВАНДРЕЙВЛАДГ4МИРОВИЧУчастиетирозиновойпротеинфосфатазы8НР-1 впередачесмгнала отрецептораинсулина03,00.04.-Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель:

стр. 3
SHP-2 срецепторомPDGF 3.1.3. Связывание S H P - 1 и S H P - 2 срецептороминсулинаСВЯЗЫВАНИЕSHP-1 с СУБСТРАТОМРЕЦЕПТОРАИНСУЛИНА- IRS-1 3.2. СвязываниеSHP-1 иSHP-2 cIRS-1 в клетках B H K - I R Связывание эндогенных SFIP-1 с IRS-1 в клетках I M 9 3.2.3. Картирование S H 2 доменаSHP-1, участвующего

стр. 57
одним и тем л<е участком этогорецептора. При этом, фосфатазы не конкурируют между собой за связывание срецепторомEGF. В отличии от этихрецепторов,рецепторинсулинасвязывает толькоSHP-2 и не взаимодействует сSHP-1. 3.2. СвязываниеSHP-1 с субстратомрецептораинсулина- IRS-1 3.2.1. Связывание

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Кривцов, Андрей Владимирович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТИРОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ.
2. БЕЛКИ УЧАСТВУЮЩИЕ В СИГНАЛИЗАЦИИ ОТ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ.
2.1. Рецепторы ростовых факторов.
2.2. Рецепторы PDGF и EGF.
2.3. Рецептор инсулина.
2.3.2. Уникальность инсулиновой сигнализации.
2.4. Сигнальные белки, расположенные «ниже» рецептора инсулина. МАРкиназный путь.
2.4.1. SH2 домены или SH2 содержащие белки.
2.4.2. Адапторный белок She (Src Homology / Collagen).
2.4.3. Комплекс Grb2/SOS.
Активация MAP киназы.
2.5. Участие IRS-1 в инсулиновой сигнализации и путь Р13-киназы.
2.5.1. Идентификация IRS-белков.
2.5.2. IRS- белки координируют разветвленную и гибкую сигнальную систему.
2.5.3. Сигнальные белки, взаимодействующие с IRS-1.
2.6. Р13-киназа и роль IRS-1 в её активации. Р13-киназный путь.
2.7. тирозиновые протеинфосфатазы SHP-1 и SHP-2.
2.7.1. SHP-1 в гематопоэтических клетках.
2.7.2. SHP-1 и SHP-2 и Т-клеточная сигнализация.
2.8. IRS-1 активирует фосфатазу SHP-2.
2.9. ингибирование сигнализации через IRS-1.
2.10. Семейство белков SIRPa.
3. СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА И РОЛЬ ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ В СИНТЕЗЕ ГЛИКОГЕНА.
3.1. Активация синтеза гликогена инсулином.
3.2. Судьба глюкозы в организме.
3.3. Стадии, определяющие скорость синтеза гликогена.
3.4. Механизм активации гликогенсинтетазы.
3.4.1. Дефосфорилирование гликогенсинтетазы приводит к ее активации.
3.4.2. Передача инсулинового сигнала на гликогенсинтетазу.
3.5. Инактивация инсулином киназы, фосфорилирующейГС.
3.6. Другие сигнальные пути, которые могут участвовать в регуляции ГС.
РЕЗЮМЕ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.
2.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.
2.1.3. Реактивы и материалы для иммунохимических исследований.
2.2. экспрессионные плазмиды.
2.3. Праймеры и пептиды.
2.4. Клеточные линии.
2.5. Культивирование клеток.
2.6. Стимуляция клеток лигандами, обработка вортманнином, конканавалином и перванадатом, лизис клеток.
2.7. иммунопреципитация.
2.8. электрофорез в ПААГ в присутствие ДСН и.
2.9. иммуноблоттинг (вестерн блоттинг).
2.10. транзиторная гиперэкспрессия.
2.11. Стабильная гиперэкспрессия.
2.12. Определение активности фосфатидилинозитол-З ' киназы.
2.13. Измерение активности гликогенсинтетазы.
2.14. Измерение включения [3Н] тимидина в ДНК.
2.15. Определение пролиферации по включению МТТ.
2.16. Измерение транспорта [3Н]-глюкозы в клетку.
2.17. Измерение фосфатазной активности.
2.18. Мутагенез in vitro.
2.18.1. Получение одноцепочечной ДНК.
2.18.2. Отжиг праймеров и построение цепи ДНК, содержащей мутацию.
2.18.3. Лигирование цепи ДНК, содержащей мутацию.
2.19. Выделение плазмиднойДНК.
2.20. Определение нуклекотидной последовательности ДНК.
2.20.1. Щелочная денатурация ДНК.
2.20.2. Отжиг праймера.
2.20.3. Сиквенсная реакция.
2.21. Ферментативное дегликозилирование белков.
2.22. Мечение клеток [3Н] глюкозаминомивыделенииеГФИ.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Сравнительная характеристика связывания SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста, EGF, PDGF и инсулина.
3.1.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором EGF.
3.1.2. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором PDGF.
3.1.3. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором инсулина.
3.2. Связывание SHP-1 с субстратом рецептора инсулина - IRS-1.
3.2.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с IRS-1 в клетках BHK-IR.
3.2.2. Связывание эндогенных SHP-1 с IRS-1 в клетках IM9.
3.2.3. Картирование SH2 домена SHP-1, участвующего в связывании с IRS-1.
3.2.4. Взаимодействие IRS-1 с SHP-1 в клетках Rati.
3.2.4.1. Дефосфорилирование IRS-1 фосфатазой SHP-1 в клетках Rati.
3.2.4.2. Сравнительная характеристика IRS-1- зависимой активации Р13-киназы в клетках Rati, экспрессирующих каталитически активную и не активную SHP-1.
3.3. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на биологические ответы клеток Rati, вызванные инсулином.
3.3.1. Активация гликогенсинтетазы.
3.3.2. Синтез ДНК.
3.3.3. Клеточная пролиферация.
3.3.4. Регуляция инсулин-зависимой активации фосфолипазы С, специфичной в отношении ГФИ в клетках Rati.
3.3.4.1. Инсулин стимулирует расщепление ГФИ в Rati клетках.
3.3.4.2. Инсулин активирует ГФИ специфичную фосфолипазу С.
3.3.4.3. Инсулин-зависимая активация ГФИ специфичной фосфолипазы С чувствительна к вортманнину.
3.4. белок SIRPa - субстрат фосфатазы SHP-1.
3.4.1. Предпосылки к изучению взаимодействия SHP-1 с SIRPa.
3.4.2. Связывание SHP-1 с SIRPa.
3.4.3. Активация SHP-1 фосфопептидами SIRPa.
3.4.6. SIRPa как субстрат для SHP-1.
3.4.6.1. Изучение взаимодействия SH0P-1 и SIRPa с помощью синтетических пептидов SIRPa.
3.4.6.2. Картирование SH2 домена SHP-1, опосредующего связывание с SIRPa.
3.5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SUP-1 -белка SIRPa.
3.5.1. Кросс-сшивка SIRPa с помощью антител не вызывает его тирозиновое фосфорилирование.
3.5.2. SIRPa образует устойчивые кластеры.
3.5.3. Влияние SIRPa на метаболические эффекты инсулина.
3.5.3.1. Транспорт глюкозы.
3.5.3.2. Активация гликогенсинтетазы.
3.6. Контроль уровня фосфорилирования SHP-1.
3.6.1. SHP-1 обладает способностью к аутодефосфорилированию.
3.6.2. Димеризация SHP-1.
3.6.3. Поиск адаптора, на котором могут образовываться димеры SHP-1.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. Взаимодействие SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста.
2. Аутодефосфорилирование SHP-1 как процесс, контролирующий уровень шрозинового фосфорилирования этой фосфатазы.
3. Участие фосфатазы SHP-1 в регуляции уровня тирозинового фосфорилирования IRS-1.
3.1. Участие инозитолфосфогликана в инсулиновой сигнализации.
4. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на митогенные эффекты инсулина.
5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SHP-1 -белка SIRPa.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.