ФАРМАКОЛОГІЧНА ДІЯ ВИСОКОЧИСТОГО НАТРІЮ ГІПОХЛОРИТУ НА ОРГАНІЗМ ТВАРИН ЗА ХРОНІЧНОГО Т-2 ТОКСИКОЗУ

Краткое содержание

Експериментальну частину дисертаційної роботи виконували у віварії ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок на білих мишах масою тіла 19-25 г і білих щурах лінії Вістар віком 4-6 місяців, масою тіла 180-200 г одержаних з розплідника Інституту фармакології та токсикології, м. Київ. Досліди на поросятах проводили у ПП "Західний Буг" Буського району Львівської області. Для експерименту були підібрані поросята великої білої породи, віком 1,5 місяці, масою тіла 10-12 кг. Дослідних тварин підбирали за принципом аналогів та утримували відповідно до правил "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" та згідно з методичними рекомендаціями "Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин" та посібника "Доклінічні дослідження ветеринарних лікарських засобів".

В експериментах використовували кристалічний Т-2 токсин, що був отриманий з лабораторії мікотоксикології Інститутуту птахівництва УААН з культури гриба Fusarium sporotrichoides. Приготовлений 1 % розчин Т-2 токсину вводили щурам внутрішньошлунково за допомогою металевого зонда з наконечником. Поросятам згодовували комбікорм, контамінований Т-2 токсином (0,14 мг/кг). Для лікування тварин, хворих на Т-2 токсикоз, застосовували розчин ВНГХ.

Визначення стабільності та гострої токсичності розчинів ВНГХ та НГХ. Встановлення оптимальних параметрів зберігання розчину ВНГХ, який виготовлений на стаціонарній установці у ДДХТУ та розчину НГХ, отриманого на установці ДЕО-01-МЕДЕК проводили в порівняльному аспекті. Концентрація розчинів на початку досліджень НГХ становила 1235 мг/л, яку визначали за активним хлором − титруванням 0,1 М розчином тіосульфату натрію. Для порівняння стабільності розчинів використовували по три однакових об’єми, які зберігали в посудині з коричневого поліпропілену впродовж 120 діб при температурі 3-5 ºС (в побутовому холодильнику), 18-20 ºС (в кімнатному приміщенні) та 30 ºС (у термостаті).

В експерименті з вивчення параметрів гострої токсичності розчинів ВНГХ та НГХ використовували білих щурів та мишей. Було сформовано 7 груп щурів та 5 груп мишей по 10 тварин у кожній групі. Дослід тривав 7 діб. Щурам І (контрольної) групи впродовж доби вводили внутрішньошлунково 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Тваринам дослідних груп (ІІ, ІІІ і ІV) задавали розчин НГХ, концентрацією 1235 мг/л, відповідно, по 10, 15, 20 мл, а тваринам V, VІ, VІІ дослідних груп – у таких самих концентраціях і дозах задавали розчин ВНГХ. Мишам І (контрольної) групи впродовж доби вводили внутрішньошлунково 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Тваринам ІІ, ІІІ дослідних груп задавали розчин НГХ концентрацією 1235 мг/л, відповідно, по 0,5; 1 мл, а тваринам ІV, V дослідних груп – у таких самих концентраціях і дозах задавали ВНГХ.

Вивчення впливу різних концентрацій розчинів ВНГХ та НГХ на кількісний склад E. coli кишок лабораторних тварин. Для встановлення впливу розчинів ВНГХ та НГХ на стан мікрофлори кишок мишей було використано розчини у концентраціях, відповідно, 100, 200, 300, 400 та 500 мг/л. З цією метою було сформовано 11 груп білих мишей: 1 контрольну та 10 дослідних груп по 15 тварин у кожній. Розчини ВНГХ та НГХ задавали per os у дозі 0,5 см³ на тварину впродовж 7 діб. Тваринам контрольної групи задавали ізотонічний розчин натрію хлориду у тих же дозах. На 5, 7, та 12 доби під легким ефірним наркозом проводили тотальне знекровлення 5-ти тварин з кожної групи та відбирали вміст товстого відділу кишок на предмет кількісного визначення кишкової палички за загальновизнаними методами.

Вивчення впливу ВНГХ на організм лабораторних тварин. Дослідження проводили на білих щурах. За принципом аналогів було сформовано чотири групи щурів, по 15 тварин у кожній. Тварини І групи (контрольної) отримували по 5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду; щури дослідних груп отримували препарат ВНГХ з різною концентрацією: ІІ група – 50 мг/л; ІІІ група – 100 мг/л; ІV група – 1000 мг/л. Розчини задавали впродовж 10 діб, на 5 та 10 доби досліду проводили тотальне знекровлення 5-ти тварин з кожної групи за легкого ефірного наркозу та відбирали кров і внутрішні органи для проведення досліджень.

З метою вивчення впливу різних концентрацій ВНГХ на гематологічні показники білих мишей нами було сформовано шість груп тварин (1 контрольну і 5 дослідних) по 15 тварин у кожній. Тваринам контрольної групи (І) задавали ізотонічний розчин натрію хлориду, мишам ІІ дослідної групи задавали ВНГХ із концентрацією 100 мг/л, ІІІ групи – 200 мг/л, ІV групи – 300 мг/л, V групи –      400 мг/л, VІ групи – 500 мг/л. Розчини задавали в дозі 0,5 мл впродовж 7 діб. Для проведення гематологічних досліджень на 5, 7 та 12 доби від початку застосування препарату при легкому ефірному наркозі проводили тотальне знекровлення 5-ти тварин з кожної групи.

Вивчення дезінтоксикуючих властивостей ВНГХ при хронічному         Т-2 токсикозі щурів. Для проведення дослідження було сформовано п’ять груп білих щурів (1 контрольну і 4 дослідних). Для відтворення Т-2 токсикозу тваринам дослідних груп (ІІ-V) упродовж 21 доби задавали Т-2 токсин у дозі 0,46 мг/кг (1/15 ЛД₅₀). Тваринам контрольної (І) групи упродовж усього досліду вводили  2 мл 1 % розчину етанолу (розчинник Т-2 токсину). Усі групи тварин мали вільний доступ до води. Тваринам дослідних груп (ІІІ, ІV, V), починаючи з 7 доби, замінили воду на розчин ВНГХ з концентрацією, відповідно, 10, 20, 30 мг/л. На 7 добу, до випоювання розчину ВНГХ, та 14, 21 доби проводили тотальне знекровлення 5 тварин з кожної групи за легкого ефірного наркозу та відбирали кров і внутрішні органи для проведення досліджень.

Визначення антитоксичної функції печінки проводили методом тіопенталової проби (Гацура В.В., 1974). Порушення функцій організму під час фізичних навантажень визначали пробою плавання за Риловою М.Л. (1964).

Вивчення впливу розчину ВНГХ на організм поросят за експериментального Т-2 токсикозу. Для досліду було сформовано 4 групи поросят, яких утримували в клітках по 8 тварин у кожній. Годівлю тварин проводили двічі на добу, доступ до води був вільний. Тварини контрольної та дослідних груп отримували комбікорм згідно з рекомендованими нормами. Поросятам І (контрольної) групи впродовж усього досліду згодовували доброякісний комбікорм, тваринам (ІІ, ІІІ, ІV) дослідних груп упродовж 20 діб згодовували цей же комбікорм, контамінований Т-2 токсином. Починаючи з 10 доби, поросятам ІІІ і ІV дослідних груп почали випоювати ВНГХ концентрацією, відповідно, 100 мг/л та 200 мг/л з розрахунку 7-10 мл/кг маси тіла за 30 хв. до годівлі тварин. Для визначення гематологічних та біохімічних показників на 10 (до випоювання розчину ВНГХ), 15 та 20 доби брали кров з хвостової вени. На 20 добу досліду з кожної групи забивали по 3 тварини, за умов легкого ефірного наркозу, проводили патологоанатомічний розтин і відбирали зразки тканин тимуса, селезінки, мезентеріальних лімфатичних вузлів, печінки, нирок, які фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну і розчині Карнуа з подальшою заливкою в парафін. На санному мікротомі з парафінових блоків виготовляли гістозрізи і фарбували гематоксиліном та еозином. Для виявлення РНК препарати фарбували за методом Браше. Розтин трупів тварин і відбір досліджуваних тканин, фіксацію та виготовлення гістопрепаратів здійснювали за загальновизнаними методиками.

У крові визначали: концентрацію гемоглобіну – гемоглобінціанідним методом; кількість еритроцитів та лейкоцитів – шляхом підрахунку на сітці Горяєва лічильної камери; лейкограму – шляхом мікроскопічної оцінки сухих, фіксованих метиловим спиртом та пофарбованих барвником Романовського-Гімза мазків крові; гематокритну величину – мікрометодом Тодорова (Кондрахін І.П. і ін., 1985). Вираховували індекси еритроцитів – середній вміст гемоглобіну в еритроциті та cередній об’єм еритроцита (В.В. Меньшиков і ін., 1987). Концентрацію загального білка в сироватці крові визначали за допомогою рефрактометра ІРФ-22; білкові фракції – нефелометричним методом; концентрацію загального кальцію – комплексометричним методом з індикатором флуорексоном (за Вічевим, Каракашевим, 1985); концентрацію неорганічного фосфору – ванадат-молібденовим реактивом (за Пулсом в модифікації В.Ф. Коромислова та Л.А. Кудрявцевої, 1985); концентрацію глюкози – глюкозооксидазним методом, активність лужної фосфатази (ЛФ) (К.Ф.3.1.3.1.) – методом гідролізу динатрійфенолфосфату за допомогою тест-наборів "Фелісіт-Діагностика", м. Дніпропетровськ; активність аспартатамінотрансферази (АсАТ) (К.Ф.2.6.1.1.) та аланінамінотрансферази (АлАТ) (К.Ф.2.6.1.2.) – уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля, кількість загального та вільного холестеролу – за допомогою наборів фірми "SIMKO Ltd", м. Львів; та вираховували відносні вагові коефіцієнти маси органів (Єлізарова О.Н., 1974).

Вивчення токсичної дії проводили відповідно до методичних рекомендацій "Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин" (1997) та посібника "Доклінічні дослідження ветеринарних лікарських засобів" (2006).

Дані гематологічних, біохімічних, патоморфологічних досліджень статистично обробляли з вираховуванням середніх арифметичних величин (М), середньої квадратичної помилки (m) і ступеня вірогідності різниці (р) між показниками. Цифрові величини виражали в одиницях СІ. Статистичну обробку результатів досліджень проводили за методикою, описаною І.А. Ойвіним (1960), з використанням програми "Excel-97"для Windows (1990). Вірогідність різниці між показниками оцінювали за критерієм Стьюдента (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

·                                Визначення стабільності та гострої токсичності розчинів ВНГХ та НГХ. Встановлено, що стабільність ВНГХ є значно вищою, ніж розчину НГХ. Упродовж 40 діб концентрація розчину НГХ зменшувалась, за умов зберігання при температурі від 3-5 ºС до 18-20 ºС, відповідно, на 9,5 та 11,1 %, а за умов зберігання при температурі 30 ºС – на 22,0 %. Через 60 діб концентрація НГХ у пробах становила, відповідно, 70, 68 та 47 %; у кінці досліду – 42,8; 39,7 та 7,2 % від початкового вмісту. Концентрація ВНГХ при температурі 3-5 ºС упродовж 120 діб практично не змінювалась і становила 93,7 %, тоді як при температурі 18-20 ºС вона становила 44,2 %, а при температурі 30 ºС – 9,7 % від початкового вмісту. Найвища стабільність розчинів була за умов зберігання при температурі 3-5 ºС.

·                                У результаті проведених досліджень з вивчення гострої токсичності розчинів ВНГХ та НГХ на лабораторних тваринах суттєвих відхилень від норми поведінки, загального стану і апетиту не встановлено, неадекватних реакцій та загибелі тварин не виявлено. Було встановлено, що згадані розчини є малотоксичними і їх слід віднести до ІV класу токсичності.

Вплив різних концентрацій розчинів ВНГХ та НГХ на кількісний склад E. coli кишок лабораторних тварин. На 5 та 7 доби застосування розчинів ВНГХ та НГХ у концентраціях 100 та 200 мг/л суттєвих змін кількості E. coli у вмісті кишок не відбувалося. При використанні ВНГХ та НГХ у концентраціях 300 мг/л кількість E. coli на 5 та 7 доби зменшувалася, відповідно, на 18,7; 25,7 і 31,0; 35,7 %. Застосування розчинів ВНГХ та НГХ у концентраціях 400 та 500 мг/л сприяло зменшенню кількості E. сoli на 5 добу, відповідно, на 23,1; 30,6 і 25,8; 35,7 % та на 7 добу, відповідно, на – 30,2; 60,5 і 59,1; 77,7 %. Період відновлення кількості E. coli після застосування ВНГХ у концентрації 100 та 200 мг/л на 5 добу відбувався значно швидше, ніж при застосуванні розчину НГХ.

Отже, застосування розчинів ВНГХ та НГХ у концентрації 100 та 200 мг/л не має негативного впливу на кількісний склад мікрофлори кишок.

Вплив ВНГХ на організм лабораторних тварин. Встановлено, що застосування щурам ВНГХ у концентраціях 50, 100, 1000 мг/л упродовж 10 діб позитивно впливає на гематологічні показники. Зокрема, концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів та лейкоцитів у всіх дослідних групах зростала порівняно з контрольною групою. Проте, у щурів ІІІ дослідної групи на 5 добу досліду вірогідно збільшилось число еритроцитів, лейкоцитів та концентрація гемоглобіну, відповідно, на 18,6 (р<0,01); 16,7 (р<0,05); 8,6 % (р<0,05), тоді як у щурів ІV дослідної групи величини цих показників були нижчі порівняно з тваринами ІІІ групи. Однак, застосування ВНГХ у концентрації 1000 мг/л сприяло зростанню еритроцитарного індексу. Зокрема, на 5 добу досліду еритроцитарний індекс збільшився в 1,3 раза (р<0,05), а на 10 добу – в 2,3 раза (р<0,001). Такі виражені зміни еритроцитарного індексу вказують на те, що задана концентрація ВНГХ (1000 мг/л) викликає зростання концентрації ендогенних токсинів, які спричиняють зміни проникності мембран еритроцитів.

При вивченні впливу розчину у концентрації 100, 200, 300, 400, 500 мг/л на гематологічні показники білих мишей встановлено, що застосування ВНГХ упродовж дослідного періоду сприяло підвищенню концентрації гемоглобіну, кількості еритроцитів, лейкоцитів у крові тварин усіх дослідних груп. Встановлено вірогідне підвищення рівня гемоглобіну та кількості лейкоцитів у крові мишей на 5 добу застосування розчину у концентрації 100, 200 та 300 мг/л, відповідно, на 7,7; 9,7 і 13,5 % та 28,2; 24,6 і 20,5 %, а на 7 добу, відповідно, – на 9,0; 10,4 і 14,8 % та 33,1; 25,5 і 21,4 %.

Отже, розчин ВНГХ у концентрації 100-300 мг/л стимулює вірогідне підвищення гематологічних показників у лабораторних тварин, тоді як концентрація 1000 мг/л викликає помірну токсичну дію.

Вивчення токсичності Т-2 токсину і дезінтоксикуючих властивостей ВНГХ при експериментальному Т-2 токсикозі щурів. На наступному етапі досліджень була визначена ЛД50 Т-2 токсину для щурів, яка в наших умовах становила 7,0 мг/кг маси тіла. Встановлено, що на початковому етапі введення    Т-2 токсину в дозі 1/15 ЛД50, клінічні симптоми Т-2 токсикозу були мало помітними. Тварини були активними, апетит добре виражений, реакції і рефлекси збережені. Починаючи з 3 доби, у деяких дослідних тварин виявили розлади функції травного каналу, що супроводжувалися розрідженням калових мас. На 7 добу Т-2 токсикозу гематологічні показники у щурів дослідних груп суттєво не відрізнялися від тварин контрольної групи. У сироватці крові тварин всіх груп встановлено вірогідне зниження величини гематокриту (p<0,01), рівня загального білка (р<0,01), холестеролу (р<0,05) та збільшення концентрації глюкози (р<0,05),  порівняно з контрольною групою.

З подальшим розвитком Т-2 токсикозу клінічні симптоми у тварин ІІ групи були виражені сильніше. На 14 добу встановлено зниження маси тіла, втрату еластичності шкіри, порушення координації рухів, тремор скелетних м’язів, що підтверджує вплив Т-2 токсину на нервову систему.

Надходження Т-2 токсину упродовж 14 діб спричиняло у тварин ІІ групи вірогідне зниження числа лейкоцитів на 24 % (p<0,05), концентрації загального білка – на 18,4 % (р<0,05) та ЛФ – на 29 % (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи.

У щурів, яким випоювали ВНГХ, клінічні симптоми не відрізнялися від тварин контрольної групи. Зокрема, тварини ІІІ-V дослідних груп були рухливі, задовільно поїдали корм, відновилась еластичність шкіри та блиск шерсті. Застосування розчину упродовж 7 діб у тварин ІІІ-V дослідних груп сприяло покращенню гематологічних показників, які наближались до величин у тварин контрольної групи. У тварин ІV дослідної групи, яким випоювали розчин у концентрації 20 мг/л, спостерігали підвищення рівня гемоглобіну на 3,5 %, кількості еритроцитів – на 2,7 %, лейкоцитів – на 3,8 %, порівняно з тваринами ІІ групи. У тварин V дослідної групи, яким випоювали ВНГХ у концентрації 30 мг/л, спостерігали підвищення рівня гемоглобіну на 2,1 % та кількості лейкоцитів –     на 6,4 % порівняно з тваринами ІІ групи.

У тварин ІІІ, ІV та V дослідних груп, яким випоювали ВНГХ, встановили зростання рівня загального білка, відповідно, на 10,0; 9,7 та 6,2 % та активності ЛФ, відповідно, на 23,3; 23,5 та 24,4 %, порівняно з тваринами ІІ групи.

На 21 добу досліду у тварин ІІ групи клінічні симптоми Т-2 токсикозу були виражені сильніше. У тварин спостерігали зниження маси тіла, блідість слизових оболонок, шерстний покрив втратив блиск, став липким та скуйовдженим, шкіра втратила еластичність. У трьох тварин встановили важке дихання з виділенням ексудату з домішками слизу. Спостерігали нервові явища, які супроводжувалися порушенням координації рухів та посіпуванням голови. Тривале надходження     Т-2 токсину в організм тварин ІІ дослідної групи поглибило токсичні явища в організмі, що супроводжувалися вірогідним зниженням концентрації гемоглобіну на 21 %, числа лейкоцитів – на 40 %, еритроцитів – на 16 %, рівня глюкози на      25 % та вільного холестеролу на 9,9 %.

У тварин, яким випоювали ВНГХ, клінічні симптоми не відрізнялися від ознак контрольної групи тварин. Зокрема, тварини ІІІ-V дослідних груп були рухливі, зникли клінічні симптоми пригнічення нервової системи – апатія, порушення координації рухів, відновилась еластичність шкіри та блиск шерсті.

Застосування ВНГХ у тварин ІІІ-V дослідних груп сприяло покращенню гематологічних показників. У крові тварин ІV та V дослідних груп вірогідно зростав рівень гемоглобіну (p<0,01), кількість еритроцитів (p<0,05), лейкоцитів (p<0,01), порівняно з тваринами ІІ групи, і ці показники наближалися до величин контрольної групи.

Біохімічні показники сироватки крові у тварин ІІІ, ІV та V дослідних груп наближались до їх величин у тварин контрольної групи.

При дослідженні динаміки зміни маси тіла у тварин ІІ групи на 7 добу встановили її зниження на 3,4 %, на 14 добу – 10,8 %, на 21 добу – 13,5 %, порівняно з контрольною групою, тоді як у тварин ІІІ, ІV та V дослідних груп маса тіла тварин на 14 добу знизилась, відповідно, на 7,7; 6,8; 7,4 %, а на 21 добу, відповідно, на 7,3; 6,8; 6,4 % (рис. 1).

При вираховуванні вагових коефіцієнтів маси внутрішніх органів встановили, що у щурів ІІ групи на 21 добу вірогідно збільшилась маса печінки у 1,3 раза (р<0,001), селезінки – у 1,1 раза (р<0,01), нирок – у 1,1 раза (р<0,05), легень – у 1,2 раза (р<0,05) та серця – у 1,1 раза, порівняно з контрольною групою, що може вказувати на розвиток дистрофічних процесів у цих органах (рис. 2, 3, 4). У той час маса тимуса знизилася у 1,4 раза (рис. 4), що вказує на імунодепресивну дію Т-2 токсину на організм. У тварин ІІІ, ІV, V дослідних груп, яким випоювали ВНГХ, вагові показники печінки, селезінки, нирок, серця, легень та тимуса були наближеними до їх величин у тварин контрольної групи, що є доказом дезінтоксикуючих властивостей розчину.

          З метою вивчення функціонального стану печінки при Т-2 токсикозі щурів, за умови застосування ВНГХ, нами проведено визначення тривалості тіопенталевого сну та проби з плавання. Встановлено, що у тварин контрольної групи тривалість сну становила 44 хв., а у щурів ІІ дослідної групи, які впродовж усього досліду одержували Т-2 токсин – 184 хв. У тварин ІІІ-V дослідних груп, яким із сьомої доби почали випоювати ВНГХ, тривалість сну становила, відповідно, 114, 102 та 102 хвилини.