ТОКСИКОЛОГІЧНА ТА САНІТАРНО-ГІГІЄНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ФУРАДАНУ : Токсикологическая и санитарно-гигиеническаф характеристика фурадану

Краткое содержание

Робота виконувалась упродовж 2003 – 2005 рр. у лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.

У процесі виконання експериментальної частини роботи проведено 1770 токсикологічних, 96 гематологічних та 780 біохімічних досліджень.

Для розробки методики тонкошарової хроматографії щодо визначення залишкових кількостей карбофурану (фурадану) в об’єктах тваринного походження та відпрацювання способів очищення екстрактів використовували фільтрацію з подальшим застосуванням хроматографії на колонці. Стандартні розчини карбофурану штучно вносили в дослідні матриці: м’ясо, печінку, молоко, яйця, жир.

Експериментальні роботи щодо встановлення валідаційних характеристик розробленого нами методу тонкошарової хроматографії для визначення залишкових кількостей карбофурану в об’єктах тваринного походження здійснювали згідно з вимогами стандарту ІSO 17025. За цих умов фурадан у кількості 2 та 10 мкг вносили в матрицю зразка (куряче м’ясо) та визначали такі валідаційні параметри: специфічність (specіfіcіty), точність (precіsіon) та правильність (accuracy), стабільність аналіту в розчині й матриці (stability), лінійність (lіnearіty), збіжність (repeatabіlіty), відтворюваність (reproducіbіlіty), межу детектування (lіmіt of detectіon) і виявлення методу (lіmіt of quantіtatіon).

Експериментальні дослідження на тваринах здійснювалися відповідно до методичних рекомендацій ”Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (Косенко М.В., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я., 1997).

У лабораторних дослідах використано 58 нелінійних білих щурів-самців масою тіла 180 – 400 г та 60 курей кросу важка м’ясна Гібро ПГ масою тіла 3000 – 4000 г та віком 1,2 – 1,3 року.

Тварин утримували у віварії ННЦ «ІЕКВМ», годували згідно з раціонами та нормами, рекомендованими для даних видів лабораторних тварин і сільськогосподарської птиці. Доступ до води був необмеженим.

Визначення ЛД₅₀ карбофурану після перорального введення здійснювали за допомогою Microsoft Excel, підпрограми Accute_LD₅₀_Calc, реалізованої на VBA (Visual Basic for Application) (Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н., 2003), яка базується на методі найменших квадратів пробіт-аналізу.

Для визначення токсикокінетичних властивостей препарату 20 щурам перорально вводили згаданий вище пестицид у дозі 5,0 мг діючої речовини (карбофурану) на один кілограм маси тіла. Через чотири години, одну, три, сім та чотирнадцять діб здійснювали декапітацію тварин після легкого ефірного наркозу та відбирали проби внутрішніх органів і тканин для визначення залишкових кількостей досліджуваного препарату та продуктів його біотрансформації.

Токсикокінетику карбофурану після одноразового перорального введення також вивчали на курах. Було сформовано три групи тварин, яким уводили фурадан у дозах 2,5 мг/кг та 5,0 мг/кг за допомогою зонду, птиці контрольної групи вводили воду. Через чотири години, одну, три та сім діб здіснювали декапітацію птиці після попереднього легкого ефірного наркозу і відбирали проби внутрішніх органів та тканин для визначення залишкових кількостей карбофурану й продуктів його біотрансформації. У кожний термін проведення експерименту відбирали й досліджували проби крові та печінки для вивчення гематологічних і біохімічних змін, які, можливо, викликає пестицид.

Здійснені дослідження включали визначення кількості еритроцитів на КФК-2 за допомогою калібрувальних графіків, загального гемоглобіну за гемоглобінціанідним методом (Кондрахін І.П., 1985).

Також проводили визначення протромбінового часу в плазмі без тромбоцитів (Меньшиков В.В., 1987; Гаранина Е.Н., 1994).

Загальний білок; співвідношення білкових фракцій; загальний та прямий білірубін; активність аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) та аланінамінотрансферази (АлАТ, КФ 2.6.1.2), холінестерази (ХЕ, КФ 3.1.1.8), лужної фосфатази (ЛФ, КФ 3.1.3.1); тимолову пробу визначали за допомогою стандартних наборів ”Філісіт-Діагностика” (Україна, Дніпропетровськ, 2005 р.).

Крім того, визначали активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) за методом Севела-Товарек та ставили пробу Вельтмана.

Визначення активності ферментів: АсАТ, АлАТ, ХЕ, ЛФ та ЛДГ здійснювали в гомогенаті печінки. Співвідношення наважки тканини (1 г) та об’єму середовища гомогенізації становило 1:5. Отриманий гомогенат центрифугували при 600 об/хв упродовж 10 хвилин та фільтрували. Після цього гомогенат розбавляли в 10 разів, що дорівнювало співвідношенню печінкової тканини та середовища гомогенізації – 1:50. Отримані супернатанти зберігали за t +4°С не більше 2 діб.

Вивчення виділення пестициду з організму тварин здійснювали на щурах після одноразового перорального введення фурадану в дозі 5,0 мг/кг з подальшим утриманням їх у індивідуальних обмінних клітках, що давало змогу щодня окремо відбирати проби сечі та калу та досліджувати їх на вміст залишкових кількостей препарату та продуктів його біотрансформації.

У зв’язку з можливими отруєннями тварин цим пестицидом виникає необхідність контролю за залишковими кількостями карбофурану в усіх об’єктах тваринного та рослинного походження.

Значна частина продуктів тваринного походження піддається технологічній обробці, зокрема м’ясо. Саме тому необхідно було вивчити вплив способів технологічної обробки курячого м’яса на вміст залишкових кількостей карбофурану. Для цього були використані такі методи:

1) термічна обробка (проварювання) впродовж трьох годин;

2) вимочування в 9 % розчині оцтової кислоти впродовж 24 та 96 годин;

3) засолювання шляхом додавання 10 % кухонної солі (NaCl) відносно маси м’яса та води впродовж 24 та 96 годин.

Визначення залишків карбофурану та продуктів його біотрансформації проводили окремо в червоних та білих м’язах до та після обробки відповідними технологічними способами.

М’язова тканина була поділена на шматки масою 100 – 150 г, ретельно очищена від залишків жиру, шкіри та кісток. Біохімічні зміни курячого м’яса вивчали за загальноприйнятими методами. За цих умов визначали величину рН, активність пероксидази та ставили формольну реакцію у витяжках із поверхневих та глибоких шарів тазостегнових м’язів (Макаров В.А., 1987).

Динаміку розподілу залишкових кількостей карбофурану та його біотрансформацію в рослинних об’єктах вивчали впродовж усієї вегетації на соняшнику – Helianthus annuus (гібрид „Еней”) після обробки насіння хінуфуром 40 % в. с. (водна суспензія, д. р. карбофуран) у дозі 18 л/т, і на буряках – Beta vulgaris: кормовому – Beta vulgaris pabularis (гібрид Полтавський білий) та цукровому – Beta vulgaris saccharifera (гібрид Український, ЧС – 70) після обробки їх насіння фураданом 35 % т. пс. (текуча паста) у дозі 35 л/т.

Соняшник досліджували в такі фази його вегетації: через 38 діб після посіву (фаза росту рослини); через 70 діб (утворення суцвіття); через 100 діб (цвітіння) та через 135 діб (фаза визрівання). Потім виявляли залишки карбофурану в макусі з насіння соняшнику. Також визначали вміст залишкових кількостей пестициду в збірних пробах бур’янів (березка польова – Convolvulus arvensis, вівсюг – Avena fatua, щириця колосиста – Amarantus retroflexus, гірчиця польова – Sinapis arvensis, мокриця – Stellaria media, лобода – Chenopodium album, суріпиця – Barbarea vulgaris тощо) з посівів соняшнику, які відбирали на 70 та 100 доби досліду.

Кормовий буряк досліджували в такі фази його вегетації: через 7, 45, 77, 107 та 142 доби після посіву.

Цукровий буряк – у такі фази його вегетації: через 17, 55, 87, 117 та 152 доби після посіву. У подальшому досліджували кінцеві продукти переробки цукрового буряка: жом та патоку.

Результати токсикологічних і клініко-біохімічних досліджень наведені у відповідності з міжнародною системою одиниць, рекомендованою для використання в клінічній лабораторній практиці, та статистично оброблені за допомогою програми Microsoft Excel for Windows 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Розробка методу визначення залишків карбофурану в об’єктах тваринного походження способом тонкошарової хроматографії. Поширене використання фурадану в сільськогосподарській практиці нашої країни вимагає контролю за вмістом його залишкових кількостей у продуктах тваринництва, рільництва та для діагностики можливих отруєнь тварин цим пестицидом.

Експериментальні дослідження щодо розробки методики визначення залишкових кількостей карбофурану (фурадану) в об’єктах тваринного походження розпочали з оптимізації реагента-проявника. Для дослідження використовували стандартний розчин карбофурану в ацетоні (0,100 мг/см³) та пластинки „Силуфол” з АСК. На кожну пластинку крапельно мікрошприцем наносили по 10 мкг карбофурану. У подальшому, за допомогою збризкувача, пластинки обробляли різними реагентами-проявниками, а саме: 15 % розчином олова хлориду в хлористоводневій кислоті – карбофурану не виявлено; здійснювали двоступеневу обробку: спочатку 15 % спиртово-водним розчином калію гідроксиду з наступним підсушуванням пластинки впродовж 10 хвилин на повітрі. Потім пластинку обробляли одним з 0,02 % розчинів солей діазонію. Дослідження здійснювали, порівнюючи три солі діазонію – міцний синій Б, міцний червоний ГГ, міцний червоний В та з використанням двох розчинників до них – ацетону та етанолу.

Отримані результати свідчили про те, що всі розчини солей діазонію виявляють карбофуран. Однак індикація пестициду за допомогою розчинів солей діазонію в етанолі чіткіше відрізнялася за забарвленням плям, ніж ацетонова. Тло пластинки при обробці спиртовими розчинами залишалося практично білим. Препарат виявлявся у формі плям бузково-червоного кольору. Завдяки цьому підвищилася контрастність плям та відповідно чіткість виявлення пестициду. Установлено, що оптимальним реагентом-проявником є спиртовий розчин міцного червоного В. Карбофуран за цих умов виявлявся у формі плям бузкового кольору на світло-жовтому тлі пластинки.

Для визначення оптимального Rf карбофурану підбирали систему рухомої фази. За отриманими результатами, найкращою виявилася суміш бензол-етилацетату в співвідношенні 2:1 з довжиною пробігу 8 см, за використання якої Rf карбофурану становило 0,68.

Наступним етапом роботи було визначення оптимального розчинника для фурадану. Для цього були використані такі реагенти: хлороформ, ацетон, гексан, бензол, етилацетат, етанол, вода. Найкращі результати були отримані під час використання води, 50 та 95 % етанолу, хлороформу.

Для відпрацювання способу екстракції карбофурану використовували суміш 1 N розчину хлористоводневої кислоти та етанолу в різних співвідношеннях: 1) 10 см³ 1 N HCl + 30 см³ етанолу; 2) 5 см³ 1 N HCl + 35 см³ етанолу; 3) 10 см³ 1 N HCl + 40 см³ етанолу. Досліджували контрольні зразки та проби печінки – 10 г, м’яса – 10 г, молока – 10 см³, яєчного жовтка – 5 г, жиру – 2 г.

Установлено, що найкращою кислотно-етанольною сумішшю для екстрагування досліджуваного пестициду є співвідношення 1:3 (10 см³ 1 N HCl та 30 см³ етанолу). Ступінь екстрагування карбофурану за цих умов дорівнював 95 – 100 %.

Отриманий екстракт відділяли від залишків матриці шляхом фільтрації. Потім його обробляли в ділильній лійці гексаном, двічі по 10 см³, для вилучення коекстрактивних речовин. Кислотно-етанольні суміші, що залишилися після обробки гексаном, додатково реекстрагували хлороформом (30 см³). Отриманий хлороформний реекстракт випарювали до об’єму 0,2 – 0,3 см³.

Для відпрацювання додаткового очищення хлороформних реекстрактів було вирішено використовувати хроматографію на колонках із шарами алюмінію оксиду та силікагелю АСК. У них вносили відому кількість фурадану, розчиненого в хлороформі. Проводили підбір елюенту, при внесенні якого в невеликому об’ємі в колонку забезпечувалося повне елюювання досліджуваного препарату. Для цього використовували хлороформ та суміш гексан-ацетону в різних співвідношеннях – 9:1, 7:1, 5:1, 3:1 та 1:1. Установлено, що хлороформ не елюює карбофуран. Це дало змогу використовувати його для додаткового очищення колонки з внесеним препаратом. Після дослідження сумішей гексан – ацетону в різних співвідношеннях установлено, що максимальне елюювання (100 %) за найменшого об’єму внесення (3 см³) забезпечує співвідношення 1:1.

Отже, розроблена нами методика визначення залишкових кількостей карбофурану (фурадану) в біологічних об’єктах забезпечує повну його екстракцію з матриці, максимальне очищення отриманих екстрактів, а також розподіл пестициду та його метаболітів у тонкому шарі силікагелю з межею визначення в м’ясі, внутрішніх органах та жирі – 0,02, а в молоці та яйцях – 0,05 мг/кг.

Валідація розробленого методу визначення залишкових кількостей карбофурану в об’єктах тваринного походження. У процесі розробки методики необхідним є проведення її валідації, тобто визначення специфічності, чутливості, точності, лінійності та відтворюваності.

Саме тому була здійснена валідація розробленої методики визначення залишків карбофурану (фурадану) в об’єктах тваринного походження способом тонкошарової хроматографії. Установлено, що вона є специфічною, чутливою, точною, лінійною та відтворюваною.

Отже, розроблена методика відповідає вимогам стандарту ISO 17025 і “Європейській інструкції щодо застосування аналітичних методів та інтерпретації результатів ЄС 657/2002”. Новизна розробки захищена Патентом № 20031213293. На підставі цього ми розробили ”Методичні вказівки щодо визначення карбофурану (фурадану) в кормах і тканинах тваринного походження (м’ясо, внутрішні органи, молоко, жир, яйця) способом тонкошарової хроматографії”, що затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, наказ № 53 від 30.06.2005 року.

Параметри гострої токсичності та токсикокінетика фурадану (карбофурану) для щурів. Перед постановкою основного досліду для визначення ЛД₅₀ фурадану 35 % т. пс. (текуча паста), діюча речовина – карбофуран, за умов його перорального введення щурам був проведений попередній експеримент з урахуванням наявних даних літератури. Уведення фурадану в організм тварин здійснювали за допомогою спеціального зонду. На першому етапі досліду було сформовано шість груп тварин, яким уводили фурадан у дозах 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 та 5,0 мг діючої речовини на один кілограм маси тіла. За цих умов жодна тварина не загинула. Тому був проведений наступний дослід. Для цього сформували ще сім груп щурів, яким уводили препарат у дозах 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 та 9,0 мг/кг. У групах тварин, яким увели дози фурадану від 5,5 мг/кг до 8,0 мг/кг, усі щури вижили, а при введенні пестициду в дозах 8,5 мг/кг та 9,0 мг/кг тварини загинули. За отриманими результатами було сформовано шість дослідних груп по шість щурів у кожній. Фурадан уводили в дозах 8,0; 8,5; 9,5; 10,0; 12,0 і 18,0 мг/кг маси тіла.

Через 3 – 5 хвилин після введення пестициду в усіх щурів, починаючи з мінімальної дози, тобто 2,5 мг/кг, спостерігали клінічні симптоми отруєння: тремтіння м’язів, потовиділення, салівацію, мимовільні акти дефекації та сечовиділення, тахікардію, сукровичні виділення з носа та очей, екзофтальм, помутніння рогівки ока. Починаючи з дози 8,0 мг/кг, деякі із щурів приймали позу ”сидячого собаки”. Усі тварини відмовлялися від корму. У більшості з них спостерігався парез задніх кінцівок. Упродовж 2 – 3 годин тремтіння м’язів то посилювалось, то зменшувалось. Загибель піддослідних тварин за групами відзначалася здебільшого впродовж перших чотирьох годин після введення фурадану. У дослідних щурів, які залишилися живими, упродовж цього часу клінічні ознаки отруєння зникали.

Під час патологоанатомічного розтину трупів виявлено такі зміни: кровонаповнення печінки, нирок, селезінки, легень; останні рожево-червоного кольору, місцями з крововиливами; судини головного мозку, брижі, шлунка та кишок гіперемійовані; серце кровонаповнене з крововиливами.

Установлено, що величина ЛД₅₀ фурадану для білих щурів за перорального введення становить 11,48±1,06 мг/кг (за діючою речовиною), ЛД₁₆ – 7,81 мг/кг, ЛД₈₄ – 15,15 мг/кг, а ЛД₁₀₀ дорівнює 16,99 мг/кг.