Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК Таняшин, Валерий Иванович

Краткое описание

Таняшин,ВалерийИванович.БактериофагТ4:молекулярноеклонированиегеновисуперпродукцияферментовметаболизмаДНК: диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.04, 03.00.03, 03.00.07. - Пущино, 1983. - 493 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
v// / - ^'^ ^ KK A Д-E М И Я Н А У К С С С Р ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ На правах рукописи УДК 577.155; 576.858.9 ТАНШИНВалерийИвановичБАКТЕРИОФАГТ4:МОЛЕКУЛЯРНОЕКЛОНИРОВАНИЕГЕНОВИ СУПЕРПРОДУЩИЯ „ФЕРМЕНТОВМЕТАБОЛИЗМАДНКД и с с е р т а ц и я на соискание ученой степени доктора

стр. 8
функциональный анализДНК^Т4-рекомбинантов, несущих фрагментыДНКиз областигенов34-63 7.17. Конструирование векторных плазмид дляклониро­ ванияфрагментовДНКобластигенов30-34 .... 7.18.КлонированиефрагментовДНК, содержащихгендигидрэфолатредуктазы в плазмидных векторах в E.coli и S.marcescens

стр. 65
<::.1'азлич{ая 3.Идентичная идентичные тупые 4.Различная идентичные или разные, тупые 5. Разшгшая различные липкие да; с помощьюферментаклонированияне с помощьюферментовкло­ нирования; образование гиб­ как в ел. I ридного сайта да; с помощьюферментакло­ * нированияДНК-шгаза высок, конц. не с помощьюферментов

Оглавление диссертациидоктор биологических наук Таняшин, Валерий Иванович
Введение . II
Обзор литературы
ГЛАВА I. Контролируемая крупноблочная фрагментация ДНК. Системы модификации-рестрикции в* coli и Т-четных бактериофагов
1.1. Бактериофаги с двух спиральной ДНК.
1.2. Гидродинамическая фрагментация ДНК.
1.3. Индуцируемая хозяином модификация-рестрикция.
1.4. Номенклатура систем модификации-рестрикции.
1.5. Генетический контроль индуцируемой хозяином модификации-рестрикции
1.6. Системы модификации-рестрикции Т-четных фагов.
1.7. Эндонуклеазы рестрикции класса II. Распространение в природе
1.8. Эндонуклеазы рестрикции класса II в E,coli.
1.9. Особенности действия рестриктаз класса II при изменении условий гидролиза, добавлении антибиотиков и при использовании необычных субстратов
ГЛАВА 2. Управляемая ассоциация фрагментов ДНК в функционирующей генетический материал
2.1. Соединение фрагментов ДНК
2.2. ДНК-лигазы
2.2.1. Механизм реакции
2.2.2. Субстратная специфичность
2.2.3. Функции ДНК-лигазы фага Т4.
2.2.4. Клонирование структурных генов полинуклеотидлигаз E.coli и фага Т4.
ГЛАВА 3. Векторы на основе плазмид E.coli и бактериофага
3.1. Блочный характер организации природных плазмид
3.2. Блоки репликации
3.3. Блоки, контролирующие стабильность плазмид
3.4. Блоки антибиотикорезистентности
3.5. Специализированные векторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии клонированных генов
3.6. Промоторы
3.7. Сайт связывания с рибосомой.
3.8. Получение негибридных белков с использованием промотора PL
3.9. Векторы с промоторами фага
ЗЛО. Получение гибридных белков с использованием промотора Р фага ^.
3.11. Плазмидные векторы, применявшиеся для клонирования фрагментов ДНК фага Т4.
3.12. Векторы на основе бактериофага . III
3.13. Общие представления о бактериофаге А. III
3.14. Размножение мутантов фага ^ в различных клетках-хозяевах
3.15. Регуляция развития бактериофага У.
3.16. Общие принципы конструирования векторов на основе фага
3.17. Выбор и использование векторов на основе бактериофага
- б
3.18. Векторы, полученные на основе фага ^ и использовавшиеся для клонирования фрагментов ДНК фага Т
3.19. Экспрессия генов прокариот в составе векторов,, полученных на основе бактериофага
ГЛАВА 4. Некоторые итоги структурно-функциональных исследований ДНК фага Т4 с помощью молекулярного клонирования in vitro
4.1. Особенности фрагментации ДНК Т-четных фагов с помощью эндонуклеаз рестрикции
4.2. Получение и характеристика мутантов фага Т4, содержащих Ц-ДНК.
4.3. Рестрикционное картирование ДНК фага Т
4.4. Клонирование фрагментов ДНК фага Т
4.5. Первичная структура некоторых областей ДНК фага
4.6. Функциональный анализ гибридных молекул ДНК, содержащих гены бактериофага Т
4.7. Использование рекомбинантных ДНК для изучения транскрипции фага Т4.
4.8. Использование банка клонированных генов для изучения репарации и репликации фага Т
4.9. Индукция мутаций в специфических генах бактериофага Т4 с использованием клонированных фрагментов и метода спасения маркера
4.10. Проблема клонирования генов фага Т4, продукты которых летальны для E.coli
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Материалы и методы.
ГЛАВА б. Ацентрический гидродинамический разрыв и возможность выделения генетических групп сцепления фага Т
6.1. Исследование гидродинамического разрыва ДНК фагов Т5+ и Т5 st(o) до и после обработки полинуклеотидлигазой
6.2. Гидродинамический разрыв и биологическая активность ДНК фагов Т4, Т5 и Л
ГЛАВА 7. Ферментативный гидролиз ДНК Т-четных бактериофагов и молекулярное клонирование полученных фрагментов.
7.1. ecoRI - рестрикция ОМЦ ДНК фага Т4.
7.2. Рестрикция Ц-ДНК фага Т
7.3. EcoRV - рестрикция ДНК Т-четных бактериофагов.
7.4. Ограничение Т-четных фагов in vivo
7.5. Получение EcoRI - ЛТ4-рекомбинантов и их идентификация
7.6. Получение Hindlll - "ХТ4-рекомбинантов и их идентификация
7.7. Клонирование EcoRV - фрагментов ДНК фага
7.8. Исследование ДНК АТ4-рекомбинантов с ранними генами фага Т4. Рестрикционный анализ ДНК !ХТ4-рекомбинантов, содержащих гены фага Т4 62,
44, 45, 46 и
7.9. Определение ориентации встроенного фрагмента
ДНК фага Т4 в составе рекомбинанта ^596
7.10. Исследование рекомбинантного фага 9596
7.11. Исследование ДНК АТ4-рекомбинантов с поздними генами фага Т
Т4-рекомбинанты, содержащие EcoRI - фрагменты ДНК фага Т4 с генами 50
7.12. /Т4-рекомбинанты, содержащие Hindlll - фрагмент ДНК фага Т4 с генами 6-12.
7.13. АТ4-рекомбинант, содержащий EcoRI - фрагмент да фага Т4 с генами 25
7.14. ^Т4-рекомбинанты, содержащие Hindlll - фрагменты ДНК фага Т4 с генами 25
7.15. Локализация участков узнавания эндонуклеазы рестрикции Smal на генетической карте фага
7.16. Рестрикционный и функциональный анализ ДНК ^Т4-рекомбинантов, несущих фрагменты ДНК из области генов 34
7.17. Конструирование векторных плазмид для клонирования фрагментов ДНК области генов 30
7.18. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих ген дигидрофолатредуктазы в плазмидных векторах в E.coli и S.marcescens
7.19. Исследование экспрессии поздних генов фага Т в составе рекомбинантных ДНК
ГЛАВА 8. Исследование функционирования генов 46, 45, 44, 62,
42 в составе Т4-рекомбинантов
8.1. Анализ экспрессии генов фага Т4, клонированных в составе бактериофага методом электрофореза в полиакриламидном геле
8.2. Комплементация in vivo
8.3. Особенности внутриклеточного развития ЛТ4-рекомбинантных фагов и их генетическая характеристика
ГЛАВА 9. Конструирование плазмидного вектора, содержащего ранние промоторы с направленно регулируемой транскрипцией
9.1. Получение гибридной плазмиды piL203 и анализ функционирования ее генов
9.2. Идентификация фрагментов гибридных плазмид
9.3. Анализ синтеза репрессора с1857 в клетках, содержащих гибридные плазмиды plL
9.4. Генетический анализ регуляторной области фага лямбда, введенной в плазмиду
9.5. Доказательство наличия в гибридных плазмидах термочувствительной транскрипции с левого фагового прэмотора
9.6. Делеционные мутанты плазмид plL202 и plL203. •
ГЛАВА 10. Конструирование штамма-суперпродуцента генетически очищенной полинуклеотидлигазы фага Т
10.1. Клонирование гена полинуклеотидлигазы фага
Т4 в плазмиде plL
10.2. Конструирование рекомбинантной плазмидой ДНК PILL435 , кодирующей синтез ДНК-лигазы фага Т
10.3. Анализ генетических маркеров в штаммах E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду piLL435 • •
10.4. Синтез ДНК-лигазы фага Т4 в клетках E.coli
AAI25, содержащих плазмиду pilL
ГЛАВА II. Обсуждение результатов
11.1. Ферментативный гидролиз ДНК Т-четных бактериофагов и клонирование полученных фрагментов
11.2. Исследование ДНК Т4-рекомбинантов, содержащих ранние гены фага Т4.
11.3. Проблема выделения генов области 30-34 фага Т4. Клонирование и экспрессия гена дигидрофолат-редуктазы в E.coli и S.marcescens
11.4. Экспрессия генов базальной пластинки фага Т4 в составе рекомбинантных ДНК.
11.5. Анализ экспрессии генов фага Т4, клонированных в составе бактериофага ^Х методом электрофореза в полиакриламидном геле
11.6. Селективные преимущества векторных плазмид, содержащих область иммунитета фага А.
11.7. Акцепторная способность гибридных плазмид с областью иммунитета фага 'А
11.8. Редуцированные плазмиды piL233, 243, 242, их селективные и акцепторные характеристики
11.9. Регулируемая экспрессия генов, встроенных в piL-плазмиды, обеспечиваемая за счет функционирования промоторов вектора. Относительное расположение промоторов и сайтов интеграции
11.10. Регуляция экспрессии клонируемых фрагментов с использованием мутантов по генам негативных регуляторов транскрипции (его, cl)
11.11. Экспрессия гена ДНК-лигазы фага Т4 в составе плазшды plLL
11.12. Перспективы исследований по клонированию генов ферментов и сверхсинтезу кодируемых ими продуктов
ВЫВОДЫ.