Конструирование системы экспрессии индуцибельной изоформы синтазы оксида азота в клетках Escherichia coli Конструирование системы экспрессии индуцибельной изоформы синтазы оксида азота в клетках Escherichia coli

Краткое описание

Гервазиев, Юрий Викторович.КонструированиесистемыэкспрессиииндуцибельнойизоформысинтазыоксидаазотавклеткахEscherichiacoli: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Москва, 1999. - 98 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 3
реакции окисленияИзоформыNOS Физиологическая рольоксидаазотаОксидазота, иммунитет и воспалениеОксидазотав сердечно-сосудистойсистемеОксидазотав дыхательнойсистемеОксидазотав центральной нервнойсистемеОксидазота- перспективы применения в терапии Общая модель строениясинтазыоксида

стр. 3
гема Антагонисты кальмодулина Аналоги NADPH Современные подходы к клонированию иэкспрессиисинтезыоксидаазотаКлонирование кДНКизоформсинтазыоксидаазотаГетерологическаяэкспрессиясинтазыоксидаазотаСпособы измерения активностисинтазыоксидаазотаМатериалы и методы Квалификация реактивов Среды

стр. 57
ЗММ бумаги, приклеивая таким образом вьюохший гель как к бумаге, так и к пластику. 58 4. Результаты исследований 4.1.Конструированиевектораэкспрессиидля ¡NOS Исходным материалом для созданиясистемыэкспрессии¡NOS являлась кДНКиндуцибельнойизоформысинтазыоксидаазотаиз макрофагов мышей, которая

Заключение диссертациипо теме «Биохимия», Гервазиев, Юрий Викторович
Выводы
1. Сконструированы гетерологические системы экспрессии функционально активной NO-синтазы: JM-109 [pCW-NOS pCAM-JL]; BL-21DE [pCW-NOS pCAM-JL]; BL-21DE [pCW-NOS pCAM-ET] в клетках E.coli. Подтверждено, что синтаза оксида азота активна только при коэкспрессии кальмодулина.
2. Функциональная активность экспрессированной ¡NOS доказана с помощью спектроскопии СО-восстановленного гемопротеина, детекции образования N0 с помощью реакции превращения оксигемоглобина в метгемоглобин а также идентификацией молекулы N0 с помощью ЭПР.
3. Определены количественные параметры экспрессии ¡NOS. Выход фермента при использовании всех трех генетических конструкций составил от 10 до 22 мг/л культуральной среды, а удельная активность от 0,42 до 0,64 U/мг белка. Эти цифры совпадают с ранее опубликованными данными других авторов.
4. Установлено, что экспрессированная нами ¡NOS связана с мембранной фракцией клеток, при этом в 105 ОООхд - супернатанте активность фермента не обнаружена. Этот факт не совпадает с имеющимися сведениями о локализации ¡NOS, в том числе и экспрессируемой в гетерологических системах. Тем не менее, взаимодействие ¡NOS с мембраной не повлияло на ферментативную активность.
5. В геноме лягушки Xenopus Laevis обнаружены неканонические нуклеотидные последовательности, кодирующие кальмодулин. Одна них была использована для конструирования вектора экспрессии для кальмодулина.
6. В ходе выполнения исследования разработана новая улучшенная схема сушки белковых гелей, которая может быть рекомендована к широкому использованию в связи с высокой экономичностью, простотой и доступностью метода для практически любой лаборатории.
89
Заключение
Установление физиологической роли простейшего химического соединения, N0,-является, по-видимому, одним из крупнейших событий в биологии за последнее десятилетие. Это вещество непрерывно синтезируется ферментативным путем в организме животных и человека, выполняя функции одного из универсальных регуляторов метаболизма. Фермент, продуцирующий основную часть N0, синтаза оксида азота , уникальна по сложности организации и включает самые разнообразные кофакторы: FAD, FMN, ВН4, гем, СаМ, Zn2+ и, по крайней мере, три в высшей степени непохожих субстрата - L-аргинин, кислород и NADPH. Проведенные в последние годы интенсивные позволили достаточно полно изучить особенности строения и функционирования NOS. Опубликовано огромное количество работ, посвященных биохимическим, физиологическим и фармакокинетическим эффектам, вызываемым N0. Тем не менее, до сих пор нет полной ясности в понимании как физиологической роли N0, так и механизмов ферментативного катализа NOS. Достаточно упомянуть, что последний из кофакторов был найден только в 1998 году, через десять лет после открытия и описания фермента.
В тексте данной диссертации вполне уместно упомянуть отечественные научные школы, занимающиеся проблемами N0 и NO-синтаз. Прежде всего необходимо отметить проф. А.Ф. Ванина, в сфере научных интересов которого такие вопросы как формы стабилизации и транспорта оксида азота в биологических системах. Работы А.Ф. Ванина, посвященные исследованию методом ЭПР в тканях животных парамагнитных нитрозильных комплексов гемового и негемового железа,
85 предшественником которых является N0, выходили в свет в конце 60-х начале 70-х годов. Таким образом, А.Ф. Ванина можно назвать одним из первооткрывателей биологической роли N0.
Среди Российских ученых необходимо отметить также проф. В.П. Реутова, занимающегося исследованием метаболизма и физиологической роли N0. Так, В.П. Реутов постулировал существование цикла оксида азота в организме млекопитающих. Этот цикл образуют две компоненты - NO-синтазные и нитритредуктазные реакции: L-аргинин -» N0 -» N027N03" ->■ N0. В институте биомедицинской химии РАМН проф. Н.С. Северина занимается исследованиями растворимой гуанилатцикпазы как промежуточного звена в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота.
В 1998 году вышел номер журнала "Биохимия", целиком посвященный исследованию N0 и NO-синтаз. Необходимо отметить, что молекулярно-биологические аспекты функционирования NO-синтаз освещались в этом сборнике авторами из Австрии [5] и лишь частично - A.A. Недоспасовым [9] в фундаментальном обзоре, посвященном конкурирующим реакциям в биосинтезе N0 и во взаимодействии его с мишенями. Вообще, надо отметить, что почти не встречается работ Российских научных коллективов, занимающихся проблемами энзимологии NO-синтаз. Таким образом данная диссертационная работа, посвященная созданию высокоэффективной системы экспрессии NO-синтазы, действительно является значимой для Российской науки. Разработанная и успешно апробированная впервые в России эффективная система экспрессии позволяет осуществить исследования по изучению структурно-функциональных свойств как нативных, так и мутантных форм ¡NOS. С помощью этой бактериальной системы экспрессии возможна наработка
86 функционально активной NO-синтазы в препаративных количествах и при небольших материальных затратах.
В процессе выполнения работы получены два интересных факта: обнаружен полиморфизм гена, кодирующего СаМ, в ооцитах лягушки Xenopus Laevis, а также отмечена не цитозольная локализация фермента ¡NOS при экспрессии в клетках E.coli. Очевидно, для того, чтобы эти факты стали научными результатами, необходимо более тщательное их исследование, что, к сожалению, оказалось невозможным осуществить в рамках данной работы.
Как уже упоминалось, СаМ представляет собой высококонсервативный белок, имеющий идентичное строение у всех позвоночных [1]. Тем более невероятно, чтобы у одного организма обнаружилось две изоформы СаМ, отличающиеся одна от другой на три аминокислоты. Следовательно, нуклеотидные замены в гене СаМ, которые приводят к аминокислотным заменам, необходимо признать артефактами -ошибками Taq-полимерэзы в процессе амплификации кДНК лягушки. Сложнее объяснить происхождение 18 замен в нуклеотидной последовательности, которые не привели к аминокислотным заменам. Маловероятно, что все эти замены являются результатом ошибки Taq-полимерэзы. Следовательно, приходится признать, что в ооцитах лягушки Xenopus Laevis найден новый ген, кодирующий СаМ. Возможно, этот ген функционирует только на ранних стадиях развития лягушки и "молчит" во взрослом организме, поэтому он не привлек внимания исследователей.
Не совпадает с литературными данными также и выявленный нами факт, что индуцибельная изоформа NOS в бактериальных клетках имеет не цитозольную локализацию, т.е. она осаждается при ультрацентрифугировании вместе с мембранной фракцией. Как уже отмечалось, изменение температуры с 16 до 37°С,
87 осаждение мембранной фракции в присутствии высокосолевых растворов ((NH4)2S04 до 20% вес/объем) не повлияли на мембранную локализацию фермента. Такое несоответствие можно объяснить следующими причинами: либо белок встраивается в мембрану, либо взаимодействует с каким-либо мембраносвязянным белком. И то, и другое событие могло произойти, например, в результате несанкционированной мутации, возникшей в процессе переклонирования кДНК ¡NOS в экспрессионный вектор. Хотя для ¡NOS описана мембранная локализация при взаимодействии его с кавеолином, маловероятно, чтобы фермент оставался связанным с белком, встроенным в мембрану, в высококонцентрированном солевом растворе. К тому же кавеолина нет в бактериальных клетках. Скорее всего, произошло именно "заякоривание" белка непосредственно в клеточную мембрану. Однако все это лишь рассуждения и предположения, у нас слишком мало экспериментальных данных, для того, чтобы сделать достоверные выводы.
Результатом диссертационной работы, не входившим в ее цели и задачи, явилась разработка нового способа сушки белковых гелей. Даже на современном уровне развития научных технологий проблема недорогой и эффективной фиксации белковых гелей не потеряла своей актуальности. Новая методика, в отличие от описанных ранее, не требует специального оборудования или дорогостоящих реактивов. К тому же гель оказывается защищенным прозрачным пластиком, что исключает возможность его случайного повреждения. К недостаткам этого метода относятся не абсолютная воспроизводимость (около 90%) и длительность фиксации геля (до 24 часов). метгемоглобин, а также идентификацией молекулы N0 с помощью ЭПР.

88