Обнаружение и изучение физикохимических свойств протеолитических ферментов гриба Eremothecum Ashbyii Цветков, Валери Цветков

Краткое описание

Цветков,ВалериЦветков.ОбнаружениеиизучениефизикохимическихсвойствпротеолитическихферментовгрибаEremothecumAshbyii: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Львов, 1985. - 148 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 2
Исследованиепротеолитическойактивности культуры . . rpH6a...E,.ashbyii--^ --3.'2. Влияние ингибиторов на активность протеиназгрибаЕ . ' 'ashbyii- -- 3,3;Изучение'изменения активности протеиназгрибаБ.ashbyii, . в процессе роста , -^ - 3»4,Обнаружениевнутриклеточных ингибиторов протеиназн с . . оптимумом

стр. 69
существует между двумя штаммамигриба.Е.ashbyii, _ "Желтый" характеризует­ ся более сложнойпротеолитическойсистемой, чем "белый" .штамм,' . что может служить косвенным указанием об.участиипротеолитическихферментовгрибав процессе флавиногенеза, ._Определяли.такжепротеолитическуюактивность, в бесклеточныхэкстрактах

стр. 74
6,0. Единственный пикпротеоли­ тическойактивности при рН 5,0 - 6,0 не существует у "желтого" штамма. - 75 3,3.Изучениеизменения активности протеиназгрибаЕ .ashbyiiв процессе роста Определяли, активностьпротеолитических.ферментовЕ.ashbyii.в разные фазы-развития культуры. Одновременно проводились

Заключение диссертациипо теме «Биохимия», Цветков, Валери Цветков
- 139 -6. ВЫВОДЫ
1. Впервые изучена протеолитическая система флавиногенного гриба E.-ashbyii . Показано существование четырех оптимумов протеолитической активности.в экстрактах из мицелия гриба при рН 4,0; 7,5; 9*5 и Щ5. В „культуральной жидкости, обнаружена протеолитическая активность с оптимумами рН 4,0 и 7,5.
2. Изучено изменение активности обнаруженных протеиназ в процессе роста гриба. Установлено, что активность этих ферментов по-разному изменяется в процессе развития культуры. Наиболее высокая активность кислой.и нейтральной протеиназ отмечена в 48-часовом мицелии, а активность.щелочных протеиназ - в 120-часовом мицелии. Уровень активности кислой протеиназы в культуральной жидкости не изменялся в процессе культивирования гриба, а активности нейтральной и щелочных, протеиназ в среде были наиболее высокими в 120-часовой культуре.
- 3.Показано,, что.при использ.о.вании. казеина.в, качестве. единственного, источника.азота.происходит.индукция.биосинтеза протеиназ с оптимумами.рН 4,0. и. 7,3. Прибавление.ионов аммония, ингибирует оинтез этих ферментов, что.свидетельствует об участии механизма азотной катаболитной репрессии.в регуляции.их образования. Ингибитор. транскрипции. 8-оксихинолин предотвращает индукцию кислой протеиназы казеином.
4. Разработана процедура очистки комплекса внутриклеточных нейтральных протеиназ/ включающая фракционирование, белков сульфатом, аммония, их температурную обработку, хроматографию на сефадексе G-75 и ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, в результате чего были выделены три фермента мицелия гриба е. ash.
- 120 -byii « протеиназы E, F и G.
5. Ингибитор сериновых протеиназ фенилметилсульфонилфторид о
С ФМСФ ) в концентрации а также п- Хлормеркуробензоат
С п-ХМБ ) в концентрации Ю^М угнетают активность протеиназ Е, Р и s. ЭДТА в концентрации 10"*% не влияет на активность протеиназы Е, активирует протеиназу F и ингибирует протеиназу ff. б. Получен выоокоочищенный препарат оериновой протеиназы Е. Определены свойства этого фермента. Оптимум рН находится в пределах 6,0 -8,5 без четко выраженного максимума,.Наиболее высокую активность протеиназа Е обнаруживает.при 60°* Фермент относительно стабилен в. интервале рН 6,0 - 9,0 ( в .течение 24 ч при . комнатной температуре сохраняет более 50$ от исходной активности). Из исследованных белковых, оубстратов С казеин,' гемоглобин, азо-казеин; азоальбумин, .альбумин сыворотки крови человека, бычий, сывороточный.альбумин ) .протеиназа. Е наиболее эффективно гидро-лизует.азоказеин. .Фермент, не расщепляет -бензоил-. i - арги-н.ин-п-нитроанилид,- следовательно он лишен амидазной. активности. Однако, протеиназа. Е.расщепляет ^-N - бензоил-аргинин метиловый эфир, выявляя эстеразную активность . .Фермент полностью ингибируетоя. ионами. не44- иСдд14* в концентрации. 10"*%. Ионы .,. Ms4",
Са"14", Со"14" и Zn"1"1".„активируют.протеиназу. Е. Особенно сильное .активирование наблюдается в присутствии .ионов Mg"1"1" С больше,, чем в.Л раза ). Молекулярная масса.протеиназы Е определена методом гель-фильтрации на сефадексе G-75 и составляет 51000 Да.
7. „Выявлен и. частично, очищен при. помощи гель-фильтрации, на сефадексе G-7.5 термостабильный, внутриклеточный ингибитор протеиназы Е; по-видимому, белковой природы. Препарат ингибитора угнетал активность протеиназы Е, а также трипсина при рН 7,5;

8. Впервые обнаружена полная инактивация ферментов флавиногене за ГТР-циклогидролазы и рибофлавинкиназы дрожжей Picbia gra.1-liermondii при инкубации этих ферментов in vitro с протеиназой Е.